氧化亚铁硫杆菌

《氧化亚铁硫杆菌》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氧化亚铁硫杆菌（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、摘要 的一组蛋白质，改变了它们的合成水平嗜酸生长期间亚铁硫杆菌 ATCC 19859于 金属硫化物，硫代硫酸盐，元素硫，和二价铁的特点是使用二维聚丙烯酰胺凝胶 电泳。N-端氨基酸测序和这些蛋白的质谱分析允许他们的身份和在A的现有基 因组序列中的相应基因的定位ATCC亚铁硫杆菌23270。各地的一些这些基因 的基因组上下文暗示他们在能量代谢参与A.氧化亚铁硫杆菌的。两组蛋白质可 以区分开来。第一种由蛋白质高度上调了增长的硫化合物（以及对亚铁增长下调） 的：一个44 kDa的外膜蛋白，远销21 - kDa的假定硫代硫转移酶蛋白，一个33 kDa的假定硫代硫酸盐/硫酸结合蛋白质，45 kDa的推定的

2、荚膜多糖输出蛋白， 和功能未知的推测的16 -kDa蛋白。蛋白质的第二组包括那些在硫下调了增长（以 及对亚铁增长上调） ： rusticyanin ，细胞色素 C552 ，一个假定的磷酸盐结 合蛋白（PST文件），核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基与大亚基和30 - kDa的 推定 CbbQ 蛋白，等等。结果表明，一般的铁和硫利用率途径的分离。Rusticyanin ，除了被高度表达于二价铁，也被新合成的，如通过代谢标记来确 定，尽管在较低的水平，对硫的化合物和不含铁的金属硫化物生长过程。在含有 铁，如黄铁矿和黄铜矿金属硫化物生长，合成上调上亚铁和那些上调对硫化合物 两种蛋白，这表明两种能量产生途径被

3、同时感应取决于可氧化的底物中可用的种 类和浓度。氧化亚铁硫杆菌（原氧化亚铁硫杆菌）是一种化能自养细菌，从二价铁，元素硫， 或部分氧化的硫化合物（6 ， 16， 26 ， 30， 41）的氧化得到它的能量。这和 目前在其栖息地溶解金属硫化物等微生物的能力在 biomining 操作成功应用（ 30 ， 41 ） 。参与二价铁的氧化反应进行了研究，详细（ 5 ， 8 ， 21 ， 26 ， 30 ， 41 ） 。 然而，从二价铁的电子通路，以氧气尚未完全建立的（44） 。末端电子受体被 认为是细胞色素氧化酶锚定到细胞膜。会发生通过几个周质的载体，其中至少包 括蓝色铜蛋白rusticyanin和细胞

4、色素C552电子的转移。最近，一种高分子量c 型细胞色素， CYC2 ，已被建议是在二价铁和氧之间的呼吸途径的初始电子受 体的主要候选者。这个途径是CYC2 - rusticyanin - Cycl或被（C552 ）- 细胞色素氧化酶评为Aa3级（44 ）。元素硫的由A杆菌等微生物的需氧氧化反应是通过一个硫双加氧酶（31 ,36-38 ） 。硫代硫酸钠已被假定为在黄铁矿（34）的硫部分的氧化的关键化合 物。含有该氧化反应的所有已显示发生化学（32,33）。然而,硫化合物氧化酶，如A氧化亚铁硫杆菌，氧化硫硫杆菌A.,或Acidiphilium acidiphilum的连 四硫酸盐水解酶也可参与该

5、过程（9，11，12，22，39）。此外，酶A杆菌或A硫杆菌的硫代硫酸盐或亚硫酸盐的氧化可成功地与铁（III）离子作为氧化 剂（34）的化学反应进行竞争。一硫氰酸酶的活性已为A氧化亚铁硫杆菌（40） 如前所述。这种酶是一种硫代硫转移酶（TST）打破了二硫键存在于硫代硫酸 盐，生成硫和亚硫酸盐。其它酶也参与硫代机制，如A氧化亚铁硫杆菌（36） 的硫代硫酸盐氧化酶。Ramirez等人。最近描述的导出TST-样蛋白A中氧化亚 铁硫杆菌，是高度表达的，当细菌生长在黄铁矿和硫，但是不能以二价铁（ 29 ） ， 并且其可能参与硫代谢。进一步研究了一些涉及的硫和金属硫化物的氧化的成分，我们分析了通过表达蛋

6、白质组学由细菌合成的蛋白质的子集上生长时的Fe （II）离子，S0,硫代硫酸 盐，黄铁矿，黄铜矿，或铁免费金属硫化物。我们的研究结果表明，合成与硫代 谢的几种蛋白质，其中包括氧化和收购，被诱导（或去阻遏）时，微生物就减少 无机硫的形式增长的。由二价铁的微生物的生长，大多数这些蛋白质的表达下调， 而二价铁氧化途径的蛋白质大大诱导，配套的铁和硫氧化途径依赖于衬底被氧化 单独调节的存在。细菌菌株和生长环境嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株ATCC 19859生长在先前介绍的 被修饰过的包含亚铁离子的9K培养基中，生长在硫元素中是通过利用硫粉来实 施的，黄铁矿（40%的铁，被发现能够穿过75微米孔径的筛子）和黄铜

7、矿的浓缩 物是Paul NOrries很友好的送给我们的，Zns和Cus购买自Aldrich，并且相应的分别包含28ppm和125ppm的微量铁，细胞在这些底物中的生长是通过在修饰 过的9K培养基中进行的，其中亚铁被相应的硫化物所代替，嗜酸氧化亚铁硫杆 菌生长在硫代硫酸盐中是通过DSMZ来实施的，培养基71包含20微升的硫代硫 酸盐和接下来的混合物（G/L： KH2P04，3.0，MgS04.7H20, 0.5，硫酸铵，3.0： 2水合氯化钙，0.25,通过添加1M的NaOH使PH保持在4.6,为了放射性标记全 细胞蛋白，洗脱过的细胞再悬浮在10毫升的相应培养基中，然后添加0.1mCi（比 活

8、，1087Ci/mmol）的含硫35的蛋氨酸，细胞最后培育在含有或不含添加物的同 样生长环境中30到40个小时。二维的非平衡PH梯度电泳，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，和射线自显 迹法。全细胞蛋白质是通过二维的非平衡PH梯度电泳来分离的，就像先前描述 的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，通过使用来自于伯乐公司的两性电解质（PH为3到10）, 来操作实施，细胞样品（4mg湿重未被标记的细胞，或者是通过让细胞生长在 含35S的蛋氨酸中来进行标记，令其含有500000cpm当量的辐射量）或者是无 细胞组分是这样来分析的，把它们放在80微升的声波降解法缓冲液中包含10 毫升的Tris-HCl pH 7.4，5毫

9、升的MgCl,和50微克/毫升的胰核糖核酸酶， 声波处理后，用DNA酶处理最终浓度，50微克/毫升），该混合物然后像先前 介绍的那样在裂解缓冲液中冻干并溶解，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳包 含12.5%的聚丙烯酰胺，或者是5%到%20浓度梯度的聚丙烯酰胺，蛋白质的序列 可以通过托马斯亮蓝的染色和先前介绍的射线自显迹法来直观的展示，在过氧化 氢存在，并且以3,3,5,5-四甲基联苯胺作为电子载体时，含有亚铁血红素组分 的蛋白质能利用它们的过氧化物酶活性来进行染色，通过这种方法，有B-巯基 乙醇存在的蛋白质要比与亚铁血红素非共价结合的蛋白质染色更深，由于在二维 聚丙烯酰胺中含有硫醇，我们最有可

10、能检测到与亚铁血红素共价结合的蛋白质， 合成出来的放射性蛋白的相对水平是通过射线自显迹法，并使用Scion图像处理 软件来检测的。萃取自二维凝胶蛋白质的微测序和质谱分析.目标蛋白是通过托马斯亮蓝染色和 通过切割蛋白颗粒的干热二维电泳来回收的，当再水化合并利用SDS-PAGE对蛋 白颗粒进行浓缩，蛋白质被电转染到聚偏氟乙烯膜上，并且拿到de Micros。 quengage des Prot eines of the Ins titut Pas teur, Paris, France.实验室进行微测序，染成银色的蛋白质，经过二维凝胶电泳，蛋白染色液胰凝乳蛋白酶消 化和萃取，最后得到分离，肽溶液是

11、通过电喷雾串联电离-质谱仪来分析的，获 得的结果通过微软的MS/MS搜索来分析，这整个MS分析是在英国剑桥，剑桥大 学，剑桥蛋白质组中心完成的.免疫印迹法，嗜酸氧化亚铁硫杆菌生长在不同的可氧化的底物上合成的蛋白质是 通过SDS-PAGE来分离的，并且电子转移到先前描述过的聚偏氟乙烯膜上，对于 抗原抗体反应，膜上的转移蛋白是用抗血清处理过的，用来作为对抗铜蓝蛋白的 一级抗体(稀释比，1:5000)，并且单克隆抗鼠抗体与过氧化物酶结合来作为二 级抗体(稀释比，1:2500)，Promega公司提出用比色法来发展Wes tern免疫印 迹，与集合在Wes tern免疫印迹上的Rus蛋白有关的强度变量

12、可以通过扫描仪和 Scion图像分析软件来监测。来自于嗜酸氧化亚铁硫杆菌的无细胞的准备嗜酸氧化亚铁硫杆菌被分解为外 膜，可溶物，和先前描述的内膜组分，可溶性组分通过第一次100,000 X g 两小时的离心，使全膜组分颗粒化，然后取自上层清液，内膜组分是在全膜组分 用2%的十二烷基肌氨酸钠处理，来分离准备的外膜组分，最后取自上清液得到。 寡核苷酸.以下的合成的寡核昔酸是需要的，用于逆转录实验中5 -CCTGCGGGTTGTCATACT-3 ; for PCRs, a (5 -CGTCTGGTTGGATAGCTG-3 ), b(5 -GTCGTCGGCGGAGGCCACCGA-3 ), c (5

13、Z -CATCGCTCAAAGGCAAAG-3 ), d (5Z -ATGGCAACGACCATGTCA-3/ ), e (5/ -CAACGTCCCGATCCCCGCGAA-3/ ), and f (5/ -GTAAAACGCTGCAAGTCG-3/ ).RT-PCR.嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC 23270的全RNA是通过先前介绍过的用于产 硫培养的改良热酚法来制备，经过苯酚萃取后，包含RNA的组分再用氯仿萃取两 次，在20 C下用乙醇处理一晚沉淀析出，用70%的乙醇洗脱，再用60微升的 无核酸酶再悬浮，接着在4微克的全RNA中加入30 U的不含RNA酶的DNA酶I 和5毫升的MgCl2,直

14、到最后体积为10微升，保持温度在37 C 一小时，最后， 提高温度到65 C保持10分钟，使DNA酶灭活。RT-RNA通过用DNA酶处理过的2ug嗜酸氧化亚铁硫杆菌全RNA来实现，在有400 纳克RT前体存在下，温度保持在70 C 5分钟，最终RNA变形，然后用冰块冷 却，根据制造商的说明，RT反应是在42 C保持1小时，并使最终体积保持在25ul来实现的，通过在65 C下加热10分钟酶会灭活，PCR是通过利用取自50 微升RT反应产物的其中3微升来执行的，该产物含有TAQ DNA聚合酶反应缓冲 液，2.5毫升的MgCl100uM脱氧核糖核苷三磷酸，5%的二甲亚砜，250ng的前 体，1U的T

15、AQ DNA酶，对于PCR，按接下来的步骤进行：首先在95 C退火3分 钟，继续把温度保持在95 C 30s，然后调到50 C保持30s，72 C保持45 秒，这样循环40次，对于每一个RT-PCR实验，必须包含一个不含有逆转录吗的 RT反应操作，用于检测被准备使用的RNA中没有被遗传物质DNA污染），RT-PCR 产物最后由添加了 0.5X TAE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳来检测序列分析碱基的识别和相似性查询是通过国家生物技术信息中心的Blastp程 序来完成的，我们利用可行的嗜酸氧化亚铁硫杆菌ATCC 23270的基因序列，该 序列已被测定但未标注，开发阅读框产物的分子质量和等电点是通过利用

16、ProtParam工具来完成的，在开发阅读框中分析过的可能存在的跨膜区已经被 TMpred预测过了。结果与讨论种植不同的可氧化物质氧化亚铁硫杆菌A全球蛋白质合成的图案。来表征一些差异，由A.氧化亚铁硫杆菌的元素硫或二价铁生长时所合成的蛋白 质，我们使用标记有放射性甲硫氨酸接着通过放射自显影的总细胞蛋白的2 -D NEPHGE分析。蛋白质合成的亚铁生长A.氧化亚铁硫杆菌的一般模式显示，从观 察到的硫细菌生长的几个不同（图（图1 ）。1 ）。分歧涉及两个上调和众多 多肽合成的下调。我们决定详细的组在图3的凝胶表明蛋白质的研究。图1中， 1中，由于所有这些多肽被考马斯蓝或银染色良好，因此可以进行高效率的N- 末端测序或质谱分析。一些低丰度蛋白（如点6和3 ）被他们点从几个相当于2 -D胶分离后集中。其它蛋白不是直接从总细胞蛋白质N-末端测序的2 -D凝胶, 但是从subproteomes组成的外膜或可溶级分从所分析