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1、生物技术制药之单克隆抗体【摘要】 杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病 的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。随着生物学 技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用DNA重组技术和抗体 库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化 抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不 足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。【关键词】 单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Mils tein创立了体外杂交瘤技术（Koehler等，1975），得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗 体走向单克隆抗体的新时代。与多克隆抗体相比，单克隆抗体具 有
2、无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化 性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。鼠源性单抗 应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human ant imouse anti body, HAMA）反应，其次是鼠单抗不 能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用 （Dhar等，2004）。减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是 鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异 的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对 抗体结构进行改造。抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗 体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基
3、因小鼠和噬菌体 展示文库等不同的阶段。1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗 体的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗 传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时， 抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞， 被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被 激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。如果能选 出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经 分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体（monoelonalantibody,简称单抗）2、单
4、抗的分类 21 鼠源性单抗目前生产的单抗大多是鼠源性的，但其在临床应用方面还存 在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体 亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）较 弱，而且它与补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱， 并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC作用的时 间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易引起宿主过敏反 应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严 重的后果，因此鼠源性单克隆抗体还应改善才能应用于临床。 22 嵌合抗体20世纪80年代中期开始研制的第一代人源化抗体，即简单的 嵌合抗体，是用人源基因代替鼠源
5、单抗的恒定区。这样构建的嵌 合抗体不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单 抗的免疫原性。美罗华（Rit uximab ）作为第一个用于肿瘤治疗 的基因工程抗体，就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。 但由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%,鼠源性抗体V 区中的框架区（FR）仍残留一定的免疫原性，可诱发HAMA反应。 灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于 短尾猿猴抗体的可变区几乎与人可变区无差异，这类嵌合抗体不 需要作任何改变，而不致发生抗体反应。23 人源化抗体由于嵌合抗体异源性仍然很大，因此需要对鼠源抗体进行人 源化改造。24 人源性抗体虽然人源化抗
6、体解决了鼠抗体的免疫原性等问题，但生产人 源化抗体仍有很大的困难；人源化过程需大量繁复、昂贵的电脑 模拟，需取代不同的氨基酸以恢复选择性和亲和力，工作量非常 大，并且它总还含有少量鼠源性成分。完全的人源性抗体才是用 于治疗的理想抗体。3、单抗的制备 31 嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区的基 因连接，再插入适当表达载体, 转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合 抗体。也就是将鼠源性单抗在保留其抗原结合活性的基础上，尽 可能的去除鼠源化部分或代之以人源化片断，减少了鼠源性抗体 的免疫原性，从而尽可能的减少单抗的异源性, 同时保留了亲本 抗体特异性结合抗原的能力。但是这种抗体仍保留
7、了30%的鼠源 性，可诱发人抗小鼠反应(HAMA)。32人源化单抗 进一步人源化的方法很多，主要是重构抗体和表面重塑技术。重构抗体就是互补决定区(compleme ntarity det ermining region, CDR)移植，将鼠抗体的CDR移植到人抗体的相应部位， 这样人源化程度可达90%以上，目前该方法是人源化单抗最常用、 最基本的方法。而表面重塑技术，即将鼠抗体框架区表面氨基酸 的残基(surface amino acid residues，SAR)进行人源化改造。 该方法是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性 并兼顾减少异源 性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨
8、基酸替换。33人源性抗体目前它主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库技术、核糖 体展示技术和转基因小鼠制备人源性抗体。3.3.1噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体 库技术。其基本原理是将蛋白质分子或肽段的基因克隆到丝状噬 菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融 合蛋白，从而使该异源分子呈现于噬菌体表面。通过这种方式， 形成了一个收藏上亿个以体外方式制得的不同抗体的基因数据 库，使从任何真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可 能。分离得到的抗体可用于制备完全人源化的单克隆抗体产品。 随着噬菌体表面展示技术的成熟与不断应用，其肽库的构建及筛 选技术得到迅
9、速发展和推广，已广泛应用于包括基因定位、分子 识别、疫苗设计等许多领域。但该技术也存在一定的局限性，如 库容量的有限性、密码子的偏爱性、氨基酸的修饰受宿主限制等， 而且该技术依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的 分子很难得到有效的表达。按噬菌体抗体库技术融合了丝状噬菌 体展示和抗体组合文库技术。基本技术路线为：应用供体外周血或组织分离单个核细胞，抽取RNA, PCR扩增出编码抗体基因片段，经酶 切后导入噬菌体、转化感受态细胞，制备噬菌体建立噬菌体组合 文库。再通过“吸附洗脱扩增”的富集过程，筛选得到特异 性的抗体基因。利用此技术，外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外 壳蛋白的基因融合，外源
10、表达产物在噬菌体的表面，从而实现编 码基因及相应的表达产物在统一体 系中的完美结合。目前已构建的噬菌体抗体有两种类型：免疫抗 体库和非免疫抗体库。免疫抗体库的抗体基因来自经疫苗注射、 微生物感染、肿瘤、自身免疫等途径免疫过的个体，这些个体的 淋巴经抗原选择和亲和力成熟，在较小的库容量即可筛选到针对 特定抗原的高亲和力的抗体，也可从羊、鸡、兔等免疫动物中获 得抗体。但免疫抗体库在针对自身抗原、抗原性较弱及有毒性的 抗原时，制备抗体较困难。非免疫抗体库包括3类：天然抗体库、 半合成抗体库和全合成抗体库。天然抗体库的抗体基因来自于未 经免疫的个体，可用于筛选多种抗原，但较小的库容只能得到中 等亲和力
11、的抗体。半合成抗体库则是由人工合成随机化的VCDR3序列；全合成抗体库则是半合成抗体可变区序列全部人 工合成。合成和半合成抗体的库容大，但亲和力较低，人工合成 的免疫原性CDR3也可能增加抗体的免疫原性。作为迄今发展最成 熟、应用最广泛的抗体库技术，噬菌体抗体库具有以下特点： 最大的特点是实现了基因型和表型的统一；表达的是完全人源 的抗体，且主要以活性片段scFv、Fab等形式表达，组织穿透性和 抗原结合性都比完整抗体具有明显优势；经过多次“吸附一洗 脱一扩增”的富集过程，可以筛选得到特异性的抗体基因；筛 选容量大，杂交瘤技术的筛选能力一般在上千克隆以内，而采用 抗体库技术可以达到106以上的
12、克隆；用途广泛，利用噬菌体展 示技术筛选出的抗体具有特异性高、容易保存、生产周期短、易 于大批量生产等特点，在大规模的工艺化生产中显示出明显优势。3.3.2 核糖体展示技术(ribosome display technology)该技术将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外 进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3末端终止密码子。核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止 密码子，停留在mRNA的3末端不脱离，从而形成蛋白质一核糖 mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，然后进行筛选， 对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行RT-PCR， PCR
13、产物进入下一轮循环，多次循环后可使目标蛋白及其编码的 基因序列得到富集和分离。目前抗体库技术还受两方面的因素影 响：从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高；受外 源基因转化率的限制，抗体库的库容不足以涵盖某种动物的抗体 多样性。大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体 的关键。核糖体展示技术避开了上述不足，可制备大容量抗体库。 该技术依赖于mRNA、核糖体和抗体蛋白（或多肽）通过非共价结 合形成三联复合体，在无细胞体系中完成转录和翻译，实现了基 因型和表型的偶联，翻译出来的抗体可用抗原进行筛选，由于不 经过体内转化，构建的抗体库库容可达到甚至超过1011。利用核 糖体展示技术可以获
14、得特异的、高亲和力的抗体。总之，抗体库 技术从根本上改变了单抗的制备流程，成为众所瞩目的生物技术 研究及开发热点之一。2004年，中国建成世界上第一个针对SARS 的基因过程抗体库。3.3.3 转基因小鼠（transgenetic mouse）在转基因动物方面，有几种不同的途径生产人抗体，其中一 种方法是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的淋巴细胞 导入严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）或Trimera小鼠，取鼠脾细 胞与人骨髓瘤细胞杂交就可能获得分泌人抗体的杂交瘤。另一个 生产人抗体的途径是通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失 活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻链基因簇的转基因小 鼠。这
15、种转人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完备的功能， 可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用 来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。Tomizuka等首先以 染色体为载体，成功培育了转染色体小鼠，并制备了高亲和力的 人抗体。日本某公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人14 号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因，但迄今尚无该技 术生产的制品问世。4、单抗的纯化4.1 细胞培养液的预处理首先需去除培养液中的细胞和细胞碎片, 最常用的方法是离 心。连续碟式分离机由于转速高、分离效果好、进出口系统全密 封而广泛应用于大规模细胞培养液的处理。但一次分离不完全, 细胞液离心后还需
16、采用深层过滤除去残留的细胞碎片, 避免在 纯化时堵塞色谱柱。深层过滤是非均相分离的基本方法之一, 主 要用于除去水和废水中的悬浮物、胶体、微生物等, 也可用于血 液制品和其他生物制品的生产。深层过滤适用于过滤固含量很少 (0.1 % )的悬浮体, 除去其中的细小颗粒。4.2 捕获色谱(capture chromatograpy)-Protein A 亲和 色谱Protein A亲和色谱是纯化抗体的首选方法之一，优点较多： 、选择性好，一步纯化所得抗体的纯度99 %；、可浓缩抗 体，洗脱液的抗体浓度10g/L、可有效灭活病毒；、适用 于所有人源的(非IgG3)抗体和Fc融合蛋白，减少缓冲液的种类 和用量。但也有局限性：、Protein A凝胶价格昂贵，是普通 色谱介质的10倍；、抗体在低pH条件下洗脱，易形成高分子聚 合物和沉淀；、脱落的Protein A配基会与抗
