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1、安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）考据方案文件编号：QYTS05007-赞同日期：年月日推行日期年月日安徽捷众生物化学有限公司文件审批表文件名称：无菌检查方法（薄膜过滤法）考据方案文件编号：QYTS05007-文件提出部门：质量控制部/QC文件起草目的：新订校订文件起草人（签字）：完成日期：年月日文件会审部门文件审察人（签字）审察日期质量管理部年月日质量保证部/QA年月日质量控制部/QC年月日生产部年月日工程(设备)部年月日文件赞同人（签字）：赞同日期年月日文件推行日期：年月日起实施文件编制依照：1、卫生部：药品生产质量管理规范2010年校订版和校订附录2、中华人民共和国药典（
2、二部）2010年版附录。文件复制人：校订人：复制份数：复制日期：年月日颁发部门：质量管理部发散单位：备注：安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）考据方案目录1考据目的2. 考据频次3. 考据操作内容与要求3.1.考据操作试验3.2试验菌要求3.3.考据方法步骤3.4.考据准备3.5考据试验操作4考据结果议论解析5附件安徽捷众生物化学有限公司无菌检查方法（薄膜过滤法）考据方案编号QYTS05007-00页数共11页拟定人拟定日期年月日校订日期年月日审察人审察日期年月日颁发部门质量管理部赞同人赞同日期年月日见效日期年月日发散部门相关部门1考据目的确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。
3、即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的正确、可靠及检验方法的完满性。2. 考据频次2.1.建立药品的无菌检查法时2.2.校订检验方法时2.3.供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时3. 考据操作内容与要求：3.1.考据时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行考据操作试验：3.1.1.对每一试验菌应逐一进行考据。3.1.2.硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌。3.1.3.改良马丁琼脂培养基白色念珠菌、黑曲霉。3.2试验菌要求：3.2.1考据试验所用的菌株传代次数不得高出5代，并采用适合的菌种珍藏技术，以保证试验菌株的生物
4、学特点。3.2.2考据试验可在供试品的无菌检查从前或与供试品的无菌检查同时进行。当同时进行时，若考据试验失败，则供试品的无菌检查结果是不行立的3.3.考据方法步骤：3.3.1考据试验的操作计划用3个不相同批号产品依照无菌检查方法（薄膜过滤法）进行平行试验，经过计算回收率来判断无菌检查方法（薄膜过滤法）可否对产品有影响。3.3.2试验结果可接受标准用无菌标准议论方法“0.9氯化钠注射液(三层共挤膜袋)的无菌检查”对检品中无菌检查试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂比较组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。3.4.考据准备：准备考据所需的供试品、培养基、试药试剂、仪器设备
5、和菌种。3.4.1.培养基硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁琼脂培养基；营养琼脂培养基；血琼脂培养基备注：培养基应注明本源；如采用市售干粉培养基，应按说明配制。配制后的培养基应依照中国药典附录“无菌检查法”中“培养基的适用性检查”项下检验无菌性和矫捷度。3.4.2仪器设备3.4.2.1.净化工作台3.4.2.2.生物洁净安全柜3.4.2.3.集菌仪3.4.2.4.生化培养箱3.4.2.5.霉菌培养箱3.4.2.6.高温试验箱3.4.2.7.台式灭菌器3.4.2.8.医药品冷藏柜3.4.2.9.微波炉3.4.2.10.器具无菌培养皿：（直径90mm）无菌移液管（5ml）等备注：以上仪器设备需要确认与
6、考据的均应已按要求考据。3.4.3.菌种3.4.3.1.金黄色葡萄球菌CMCC（B）260033.4.3.2.枯草芽孢杆菌CMCC（B）635013.4.3.3.白色念珠菌CMCC（F）980013.4.3.4.黑曲霉CMCC（F）980033.4.3.5.铜绿假单胞菌CMCC（B）101043.4.3.6.生孢梭菌CMCC（B）649413.4.4操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于C级，净化工作台洁净度为A级。操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于10pa。试验样品：0.9氯化钠注射液(三层共挤膜袋)规格：250ml批号：生产日期：批号：生产
7、日期：批号：生产日期：稀释液和试剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌十四烷酸异丙酯3.4.7考据用微生物名称及其编号实验菌株的本源：序号菌株名称菌株代码及编号内控编号1金黄色葡萄球菌CMCC（B）260032铜绿假单胞菌CMCC（B）101043枯草芽孢杆菌CMCC（B）635014白色念珠菌CMCC（F）980015生孢梭菌CMCC（B）649416黑曲霉CMCC（F）98003编号由菌名首字母传代代数制备日期组成3.4.8培养基名称生产商培养基批号配制日期有效期营养琼脂培养基改良马丁琼脂培养基3.5考据试验操作：3.5.1试验菌的制备和稀释：3.5.1.1将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆
8、菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在3035下培养1824小时，将白色念珠菌接种至良马丁流体培养基中，2328下培养2448小时。3.5.1.2将黑曲霉接种至改良马丁琼脂培养基中，在2328下培养57天小时。3.5.1.3将上述培养物用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌落数为50100cfu的菌悬液。3.5.2用不相同类其余微生物察看供试液及检验程序的抑菌性，将试验分为4组3.5.2.1样品试验组：A正确取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠适合容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。B尔后加入45的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100m
9、l，振摇510分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1：10的供试液。C用移液管正确吸取1.0ml供试液至平皿中；并在每个平皿中接种50100cfu试验菌，马上倾注营养琼脂培养基，每个试验菌平行接种2个平皿，依照平皿法测定其菌数。3.5.2.2菌液组：按中国药典附录“无菌检查法”中“矫捷度检查”项下的菌液制备A在平皿中注入1ml的菌液马上倾注营养琼脂培养基，以测定所加的菌数。B供试品比较组取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品的本底菌数。C稀释剂比较组取相应稀释液1ml加入试验菌，使最后菌浓度为每ml供试液含50100cfu试验菌，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数。
10、D 对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不相同的试验人员的测定结果可能有很大的误差。所以在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。E 当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体分别于稀释液中。F 为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍系列稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。G 液体培养物直接稀释法较比浊法造成误差小，基本保证每次菌数能控制在要求的范围内。I最后制得的菌悬液应为小于100CFU/ml。J 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌采用营养琼脂培养基；生孢梭菌采用血琼脂培养基；白色念珠菌、黑曲霉采用改良马丁琼脂培养基。3.5.3培养
11、将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌在3050下培养48小时将白色念珠菌、黑曲霉在2328下培养72小时，点计菌落数。并将结果记录于附件1。3.5.4试验结果3.5.4.1稀释剂比较组菌的回收率0.9氯化钠注射液菌落计数（cfu/皿）接入菌种回收率批号稀释剂比较组菌液组金黄色葡萄球平均值铜绿假单胞菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值生孢梭菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=稀释剂比较组的平均菌落数菌液组的平均菌落数100%。3.5.4.2试验组的菌的回收率0.9氯化钠注射液菌落计数（cfu/皿）回收率接入菌种批号试验组供试品比较组金黄色葡萄球平均值铜绿假单胞菌平均值枯草芽孢杆菌平均值白色念珠菌平均值生孢梭菌平均值黑曲霉平均值表中：回收率=（试验组的平均菌落数供试品比较组的平均菌落数的值）菌液组的平均菌落数100%。4考据结果议论解析4.1对考据结果的评审应包括：（1）考据
