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1、DNA提取以玉米为例的dna提取注意事项及方法。DNA提取以及DNA提取的注意事项1、裂解液要预热加速蛋白变性，促进DNA溶解。2、苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。5m:d!o8g%3A*酚一定要碱平衡。3、各操作步骤要轻4、取各上清时，少许即可5、异丙醇，乙醇等要预冷，以减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。避免剧烈吸打DNA,不能搅动基因组DNA。DNA的降解。7、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断
2、8、要用新鲜样品或液氮冷冻9、DNA的可能性。-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性10、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。11、%F+R*A2Z-g12、基因组应4度保存，如13、在准备实验的过程中，应将14、用Tris缓冲液溶解15、加缓冲液后，为了加速16、加入缓冲液后，置于17、将DNA溶液65度温育18、吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断20度保存可能导致DNA断裂。DNA样品放在碎冰上。DNA。DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。4度过夜，也可以溶解DNA。10分钟，可以灭活。在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚仿
3、抽提的次数或适当延长离心的时间。19、酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量DNA或造成DNA缺口。%c#/氯TES稀释后再抽提DNA样品。因此如何提取玉米是重要的粮、经、饲兼用作物，同时还是制药、淀粉糖浆、油料、酒精工业的主要原料，种植面积仅次于小麦和水稻，是世界第三大作物，我国玉米种植面积和总产量都居世界第二位。在世界及我国的经济生活中具有非常重要的地位和作用。然而，随着植物科学向分子水平的深入发展，玉米选种、育种、改良和鉴定等研究中经常需要获得有效的植物DNA的提玉米的DNA是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，如不能有效地完成玉米取，那就无法进行分子生物学方面
4、的实验。玉米DNA的有效提取，它是进行任何玉米研究工作的前提和基础，也是最关键的一步。自Marmur于1961年建立用十二烷基硫酸钠（SDS）和氯仿从细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来，研究者一直在探索能制备DNA制品的最佳方案。迄今为止国内外报道的植物DNA提取方法多达好几十种，如十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法1厂、十二烷基硫酸钠（SDSDO、DNApengent法、简易操作方法、高盐低pH法、碱裂解法、Zigenhagen法、Dneasyplantli-ets法、S法、脲法、DraperandScott法、Csclgradient法、CTAB/Csclgradient法、苯酚法、采
5、用基因释放剂提取DNA的方法、采用试剂盒提取DNA的方法等。下面就几种玉米常用的DNA提取方法进行详细综述。1.CTAB法，是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高浓度盐溶液中(0.7mol/LNacl是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/LNacl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高浓度盐溶液!再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。CTAB法能很好地去除糖类杂质，对于含糖较高的材料可优先采用。程备久等在1996年,就采用玉米鲜叶不经干处理直接用CTAB000DNA,其分子量和
6、纯度均较高，可用于限性切、基因文库构建及基因组分析等。2、SDS法。利用高浓度的SDS在较高温度口55口65皿条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，最常用的方法是加入5mol/L的KAc于冰上保存，低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物。离心除去沉淀后，上清液中的DNA反复用酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。3、采用试剂盒提取DNA。所谓DNA提取试剂盒是指包含了提取植物DNA所需的试剂，能直接用于提取高质量的DNA。4、简易操作方法。简易操作方法是通过优化CTAB法与SDS法等几种基本方法的操作步骤，试剂用量
7、与作用时间所建立的一种改良的DNA快速提取方法。综上所述，在玉米基因组DNA的提取上的研究取得了令人瞩目的进展，随着分子生物学实验技术的发展，DNA提取方法也在逐步完善，操作步骤更加简单、成本更低、得到DNA的产量和质量也越来越高。在玉米遗传多样性研究、分子标记辅助选择、转基因后代的检测、分子标记定位、纯度鉴定等遗传育种领域具有更广阔的应用前景。RNA的提取注意事项RNA抽提纯化是分子生物学研究的基本工作内容。但是由于本性，使得的广泛应用使得让人头痛的。DODO，RNA的抽提纯化和后续工作特别困难。虽然RNA抽提和纯化不再特别困难，RNA工作的主要问题是防止但是涉及RNA酶的污染。RNA酶的广
8、泛存在和难以灭活的顽固Trizol试剂和各类RNA抽提纯化试剂盒RNA的工作仍然是分子生物学研究中最任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。为此，必须作到以下几点：1.如果可能，实验室应专门辟出RNA操作区，离心机，移液器，试剂等均应专用。保持清洁，并定期行除菌。2.0000，在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，3.操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具，尽避免使用一次性塑料手套。塑料手套不但常常造成操作不便，且塑料手套的多出部分常常在器具的RNaseDO
9、DORNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，RNA酶的污染,从而导致整个实验的失败。因此，可以有效避免操作中引起的RNase-free处传递RNA操作区应RNA酶污染。RNase，扩大污染。RNA酶污染。tips,tubes等，以防交叉污染。例RNaseH，T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、RNA操作的大敌。4、避免在操作中说话聊天。也可以戴口罩以防止引起5、尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免共用器具如滤纸，如，从事RNA探针工作的研究者经常使用离心机等的污染。而这些污染了的器具是6、关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用
10、于的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。7、配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。一些RNA提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。8、在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。9、有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50D60口，并将反应时间缩短到用量必须提高10D20倍。溶菌酶使用时缓冲
11、液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。10、许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。11、许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。克服多糖污染可采用以下一些办法CTAB多次抽提。在有机溶剂沉淀时先稀释样
12、品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到tips和tubes等。多数厂家供RNA操作。许多研究者用DEPC等处理以释放更多的游离核酸，5mM15D25min，但酶1)2)3)1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。12、在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚
13、，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。13、在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提更要避免剧烈操作。14、在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。15、在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间皿将有助于增加核酸的沉淀量。16、在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好
14、复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。17、核酸提取后可通过PCR、RTDPCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACEDdd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。11D在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。/氯仿混合变性，也可用单一酚作DNA时，2V乙醇沉淀，但70DO30min;D20口过夜.提取RNA请尽量在18.所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，用双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸
