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1、、酶活测定方法还原法 酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。色原底物法 通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。粘度法 该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和-葡聚糖会被
2、切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。免疫学方法 常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品
3、中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。琼脂凝胶扩散法 将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。 蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO42H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO42H2O)25g,蒸馏水
4、700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No45)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000m
5、L。1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质
6、。1.1.6 100g/mL酪氨酸溶液:精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000g/mL,再吸取此液10mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100g/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。1.2 仪器a. 分析天平: 感量0.1mg;b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计;c. 水浴锅;d. 1、2、5、10mL移液管等。1.3 操作1.3.1 标准曲线的绘制1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。表 1 配制各种不同浓度的
7、酪氨酸溶液 管 号试 剂 1 2 3 4 5 6蒸馏水,mL 10 8 6 4 2 0100g/mL酪氨酸,mL 0 2 4 6 8 10酪氨酸最终浓度,g/ml 0 20 40 60 80 1001.3.1.2 测定步骤:取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20min在581-G型光电比色计上分别测定光密度(OD) (滤色片用65*#)或用72型分光光度计进行测定(波长660nm)。一般测三次,取平均值。将16号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD
8、数。为了清楚起见。再列出表格如下 (表2)。表 2 管 号试 剂 1 2 3 4 5 6按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL 1 1 1 1 1 10.4mol/L Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福林试剂,mL 1 1 1 1 1 1 1 2 O D值 3 平均 净O D值 0 以净O D值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)。1.3.2 样品稀释液的制备。1.3.2.1 测定酶制剂: 称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。1.3.2.2 测
9、定成曲酶: 称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40水浴内间断搅拌1h,过滤,滤液用0.1mol pH 7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。1.3.3 样品测定: 取15100mm试管3支,编号1、2、3(做2只也可),每管内加入样品稀释液1mL,置于40水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温10min,时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,
10、摇匀,40保温发色20min后进行光密度(OD)测定。空白试验也取试管3支,编号(1)、(2)、(3),测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。为了清楚起见,分别列出表格于下 (见表3及表4)。表 3 管 号 试 剂 管 号试 剂 1 2 3 (1) (2) (3)预热酶液, mL 1 1 1 预热酶液, mL 1 1 1预热2%酪蛋白, mL 1 1 1 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2作用10min (精确计时) 作用10min (精确计时) 0.4mol三氯乙酸, mL 2 2 2 预热2%酪蛋白, mL 1 1 1表 4 管 号试
11、剂 1 2 3 (1) (2) (3)滤 液, mL 1 1 1 1 1 10.4mol Na2CO3,mL 5 5 5 5 5 5福林试剂, mL 1 1 1 1 1 1O D值 平均O D值 净O D值 0样品的平均光密度(O D)一空白的平均光密度(OD)=净OD值。1.4 计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。A 1样品蛋白酶活力单位(干基)=4N (1)10 1 - W式中:A由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值K);44毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍);N酶液稀释的倍数;10反应10min;W样品水分百分含量。1.5 注意事项以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH缓冲液配方提供如下:1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L)称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO42H2O)0.5g以蒸
