《薄层层析操作要点》由会员分享，可在线阅读，更多相关《薄层层析操作要点（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、薄层层析操作要点铺板铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表 面较粗糙。匀浆配比一般是硅胶G:水=1： 23,硅胶G:羧甲基纤维素钠水溶液=1:2。研磨匀浆的时间， 根据经验来定，与空气湿度有关，一般通过拿起研棒时匀浆下滴的情况来判断，越稠越难下滴。匀浆的 稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显 色不那么明显。通常，板的质量对薄层鉴别的影响不是很大，影响最大的是展开剂的配制和展开系统的 饱和。铺层时防止起泡,可加几滴乙醇.尝试刮边点样尽量用小的点样管。如果有足够的耐性，最好只用1 微升的点样管。这
2、样，点的斑点较小，展开的 色谱图分离度好，颜色分明。样品溶液的含水量越小越好，样品溶液含水量大，点样斑点扩散大。样品 溶液的溶剂一般是无水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干或放入干燥 器里晾干。点样是造成TLC定量误差的主要来源。实验证明：定量毛细管更适合较小体积的点样；微量注射器更适合较大体 积的点样。这主要是因为微量注射器受小气泡、溶液回爬现象的影响较大。为避免不同定量毛细管间的点样误差、建 议一块薄层板上最好用同一只定量毛细管。但应注意更换样品时，应将毛细管用超声波或不同极性溶剂清洗干净。在 制备样品时，溶样溶剂黏度不能过高，以便于点样；溶剂沸点过低则进样体积易
3、变，过高则会改变展开剂组成；对样 品溶解度过高会使样点发生空心现象；常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮。经典TLC样点原点一般为直径3mm点间距1-2cm 底边距1.5cm； HPLC样点原点一般为直径1mm点间距5mm底边距1cm。展开剂配制选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗，强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用 体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合不均 匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的 要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1 ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，移
4、液管应 符合计量认证要求，尽管多数时候这不是必须的。展开系统的饱和一般使用的是双槽的展开缸，一槽用来放展开剂，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展开的板放入两 槽间的平台，斜架着，盖上展开缸的盖子。让展开剂的蒸气充满展开缸，并使薄层板吸附蒸气达到饱和， 防止边沿效应，饱和时间在半个小时左右。展开时难免要打开盖子把薄层板放入展开剂中，不过对薄层 板与蒸气的吸附平衡影响不大，当然动作应该尽量轻、快。温湿度的控制 温湿度对薄层影响都很大。不冻结的前提下，通常温度越低分离越好，较难的分离需在低温下分离， 例如人参皂苷。湿度的影响，估计主要是影响薄层板的吸附能力，导致选择性（容量因子）的变化，湿 度应根据实际
5、情况确定。温度控制使用空调器或冰柜，湿度控制是通过在另一展开槽放置相应浓度的硫 酸。展开剂的选择TLC与HPLC相比，一个突出的优点就是流动相的选择具有更大的灵活性。流动相的选择的目的是使绝大部分样品 的 RF 值位于 0.1-0.7 之间并达到较好的分离，与此对应的是流动相要有适当的强度和组成。流动相强度越大，溶质 RF 值越大，但很可能降低分离能力；另外单一溶剂很难分离较复杂的混合物，根据相似相溶原理，要使用多元溶剂体 系。一般展开剂体系选择如下：根据分离样品性质、薄层色谱板性质选择一个二元溶剂体系，通过调节溶剂比例以寻 求适合RF值，适合的RF值找到后，再寻求极性参数相同的二元溶剂体系两
6、个，以这三个组成为三点组成一个三角形， 则可看到：三角形顶点是二元体系，边是三元体系，三角形内是四元体系，并且极性一致，可根据几何原理得出任一 点组成。这种方法较为直观，也较简单。显色喷显色剂显色最重要是有好的雾化器。TLC的通用显色方法理想的显色希望灵敏度高、斑点颜色稳定、斑点与背景间的对比度好、斑点的大小及颜色的深度与物质的量成正 比。在样品组成并不完全已知的情况下，通用显色方法显得成尤为重要。通用显色法主要有：(1) 紫外照射法：方便，不破坏样品；(2) 碘蒸气法：通用性强，与紫外法结合灵敏度高于该两法单独使用；(3) 荧光试剂：制造荧光背景，使原来紫外下无荧光物质被鉴别，有荧光物质更明
7、显；(4) 硫酸溶液：对绝大多数有机物有效，但有破坏性。薄层层析(thin layer chromatography)，也叫薄层色谱、薄板色谱或薄板层析，属层析技术中的一类，常用TLC 代表。如同柱层析一样，按其作用机理可分为吸附薄层层析，分配薄层层析等。其中应用最广泛的是吸附薄层层析。 其原理见第97100页和第102104页。薄层层析具有微量、快速、操作简便等优点，但不适合于较大量的样品的分 离，通常可分离的量在0.5g以下，最低可达10-9 g。以下介绍吸附薄层层析的相关问题，其他类型薄层层析可参照处理。1. 薄层层析的用途 在实验室中，薄层层析主要用于以下几种目的。作为柱层析的先导。一
8、般说来，使用某种固定相和流动相可以在柱中分离开的混合物，使用同种固定相和流动 相也可以在薄层板上分离开。所以常利用薄层层析为柱层析选择吸附剂和淋洗剂。(2) 监控反应进程。在反应过程中定时取样，将原料和反应混合物分别点在同一块薄层板上，展开后观察样点的相 对浓度变化。若只有原料点，则说明反应没有进行；若原料点很快变淡，产物点很快变浓，则说明反应在迅速进行； 若原料点基本消失，产物点变得很浓，则说明反应基本完成。(3) 检测其他分离纯化过程。在柱层析、结晶、萃取等分离纯化过程中，将分离出来的组分或纯化所得的产物溶样 点板，展开后如果只有一个点，则说明已经完全分离开了或已经纯化好了；若展开后仍有两
9、个或多个斑点，则说明分 离纯化尚未达到预期的效果。(4) 确定混合物中的组分数目。一般说来，混合物溶液点样展开后出现几个斑点，就说明混合物中有几个组分。(5) 确定两个或多个样品是否为同一物质。将各样品点在同一块薄层板上，展开后若各样点爬升的高度相同，则大 体上可以认定为同一物质，若上升高度不同，则肯定不是同一物质。(6) 根据薄层板上各组分斑点的相对浓度可粗略地判断各组分的相对含量。(7) 迅速分离出少量纯净样品。为了尽快从反应混合物中分离出少量纯净样品作分析测试，可扩大薄层板的面积， 加大薄层的厚度，并将混合物样液点成一条线，一次可分离出数十毫克到五百毫克的样品。2. 薄层层析的仪器和药品
10、(1) 薄板薄层层析所用的基板通常为玻璃板，也有用塑料板的，根据用途的不同而有不同的规格。作分析鉴定用的 多为7.5cmX2.5cm的载玻片。若为分离少量纯样品，可将普通玻璃板裁成20cmX15cm的大小，将棱角用砂纸稍加打 磨，以免割破手指，然后洗净干燥即可使用。近年来，有些厂商将吸附剂涂在大张金属箔片上出售。购回后只需用剪 刀剪成合适大小即可点样展开。用完后可以适当溶剂将箔片上样点浸萃掉，经干燥后即可重复使用，但吸附剂涂层很 薄，一般只可作分析鉴定用。(2) 展开槽展开槽也叫层析缸，规格形式不一。图3-39绘出了其中的几种，图中的a为立式，b为卧式，c和d为 斜靠式，e为下行式，f为制备纯
11、样品所用的大型展开槽，亦为斜靠式。a,b,c,d,f统称上行式。(3) 吸附剂薄层层析中所用吸附剂最常见的有硅胶和氧化铝两类。其中不加任何添加剂的以H表示，如硅胶H,氧 化铝H；加有煅石膏(CaSO 41/2H20)为粘合剂的用G表示(gypsum),如硅胶G，氧化铝G；加有荧光素的用F表示 (fluorescein)，如硅胶HF2 5 4，意思是其中所加荧光素可在波长254 nm的紫外光下激发荧光；同时加有煅石膏和 荧光素的用GF表示，如硅胶GF2 5 4，氧化铝GF2 5 4。如在制板时以羧甲基纤维素钠的溶液调和，则用CMC表 示(carboxymethyl cellulose)，如硅胶C
12、MC。添加粘合剂是为了加强薄层板的机械强度，其中以添加CMC者机械强度 最高；添加荧光素是为了显色的方便。习惯上把加有粘合剂的薄层板称为硬板，不加粘合剂的薄层板称为软板。供薄层层析用的吸附剂粒度较小，通常为 200目，标签上有专门说明，如 Silica gel H for thin layer chromatography,使用时应予注意，不可用柱层析吸附剂代替，也不可混用。薄层层析用的氧化铝也有酸性、中性、碱性之分，也分五个活性等级。选择原则与柱层析类同。(4) 展开剂在薄层层析中用作流动相的溶剂称为展开剂，它相当于柱层析中的淋洗剂，其选择原则也与淋洗剂类同, 也是由被分离物质的极性决定的，
13、被分离物极性小，选用极性较小的展开剂；被分离物极性大，选用极性较大的展开 剂。环己烷和石油醚是最常使用的非极性展开剂，适合于非极性或弱极性试样；乙酸乙酯、丙酮或甲醇适合于分离极 性较强的试样，氯仿和苯是中等极性的展开剂，可用作多官能团化合物的分离和鉴定。若单一展开剂不能很好分离， 也可采用不同比例的混合溶剂展开。选择展开剂的一条快捷的途径是在同一块薄层板上点上被分离样品的几个样点，各样点间至少相距1cm，再用滴管 分别汲取不同的溶剂，各自点在一个样点上，溶剂将从样点向外扩展，形成一些同心的圆环。若样点基本上不随溶剂 移动(见图3-40a)，或一直随溶剂移动到前沿(见图3-40d)，则这样的溶剂
14、不适用。若样点随溶剂移动适当距离，形成 较宽的环带(见图3-40b)，或形成几个不同的环带(见图3-40c)，则该溶剂一般可作为展开剂使用。图3-40 选择展开剂图3-41载玻片浸渍涂层3. 薄层层析的操作（1）制板制板也称铺板或铺层，有“干法”和“湿法”两种，由于干燥的吸附剂在玻璃板上附着力差，容易脱落， 不便操作，所以很少采用，此处只介绍湿法铺板。a. 供分析、鉴定、监控用的载玻片的铺制。首先将吸附剂用溶剂调成糊状，所用溶剂可以是低沸点有机溶剂，也 可以是蒸馏水。有机溶剂中应用较广的是氯仿，一般按照每克硅胶3mL氯仿的比例在广口瓶中调成糊状，立即以带螺 旋的盖子盖紧备用。在铺板时用力摇匀，
15、旋开盖子，将两块载玻片叠在一起，以食指和拇指捏住它们的侧面靠近一端 处，缓慢平稳地浸入瓶中的糊状吸附剂里，使糊状物浸没至离载玻片顶端约1 cm处，然后缓缓提起（见图3-41），在空 气中握持片刻，使氯仿大部分挥发掉。将两块载玻片拆开，浸涂面向上，平放在桌上，干燥后即可使用。每次浸涂后 应立即将广口瓶盖紧密封，以免溶剂挥发。这样制得的薄层板机械性能稍差。为了提高薄层强度，可用甲醇代替氯仿, 或将甲醇与氯仿按不同的比例混合使用。以蒸馏水作溶剂时，首先将待铺的载玻片平放在水平台面上，将吸附剂置于干净研钵内，按照每克硅胶G23mL 蒸馏水（或34mL羧甲基纤维素钠溶液），或每克氧化铝12mL蒸馏水的比
16、例加入溶剂，立即研磨成糊状。用牛角匙 舀取糊状物倒在载玻片上迅速摊布均匀，也可轻敲载玻片边缘，或将载玻片托在手中前后左右稍稍倾斜，靠糊状物的 流动性使之分布均匀。然后再平放在台面上，使其固化定型并晾干。固化的过程是吸附剂内的煅石膏吸收水形成新固 体的过程，反应式为：CaS04 1/2H20 + 3/2H2O = CaS04 2H20所以研磨糊状物和涂铺薄层板都需尽可能的迅速。若动作稍慢，糊状物即会结成团块状无法涂铺或不能涂铺均匀, 即使再加水也不能再调成均匀的糊状。通常研磨糊状物需在1min左右完成，铺完全部载玻片也只需数分钟，最多在十 数分钟内完成。每次铺板都需临时研磨糊状物。以蒸馏水作溶剂制得的薄层板具有较好的机械性能，如欲获得机械性 能更好的薄层板，可用1%的羧甲基纤维素钠水溶液来调制糊状物。将1g羧甲基纤维素钠加在100mL蒸馏水中，煮沸使 充分溶解
