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1、TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 的染色体DNA在Ca +和Mg+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标
2、记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用
3、。一、过氧化物酶标记测定法 原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin）-11-dUTP在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。 毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细
4、胞Fc受体非特异性的吸附作用。 本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。检测晚期凋亡。基本原理： 对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dTUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dTUTP与核断裂的DNA 3-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dTUTP上biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。罗氏试剂盒
5、一、 试剂1、酶浓缩溶液550l末端脱氧核糖核酸转移酶 （10）试剂2、标记溶液5550l含有核苷酸混合液的反应液 （1）试剂3、转化剂-POD 3.5ml酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后4保存）二、所需的溶液和仪器10mM Tris/HCl（pH7.47.8）、PK配制、DAB、饭盒、吹风机、3%H2O2甲醇溶液、PBS、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）1, 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min5；3%过氧化氢甲醇中浸洗10-15min，
6、抑制内源性过氧化氢酶。用蛋白酶K（20g/ml溶于Tris/HCl中，pH7.48.0）室温孵育1530分钟。PBS洗约5min*2次，擦干样品周围的水。此阶段配制TUNEL反应混合物从试剂2中取出100l标记溶液作为两个阴性对照；将试剂1中取5l+试剂2中45l标记液中，配成50l TUNEL反应混合物混匀（即配即用，4避光！）标记反应：滴加50l的TUNEL反应混合液，在湿盒中37孵育60分钟（为防蒸发和保证TUNEL 反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*3次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果。信号转化和分析：擦干样品周围的水分，加入50ul转化剂-PO
7、D，湿盒中37孵育2030分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）。PBS洗5min*35次 加入50100l DAB底物溶液，室温（1025）孵育510 min，PBS洗5min*3次。（苏木素染1-3秒，以免视野全染，需要摸索条件）中性树胶 或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果。稳定性：TUNEL反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好的此液体必须将放入冰浴中。2、转化剂-POD （即用型）：一旦融化此液体，需在4保存（最多保存6个月），并且不能反复冻存。蛋白酶K一般工作液浓度为20ug/ml,但浓缩液可配制110mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100mM Tr
8、is HCl PH8.0+50mM EDTA）； 注意：1)蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（come off the slide）,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为1030 min，4um左右的片子可以用10 min，但30 um左右的可用30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。2)对于比较困难的组织，可以选用0.1M pH6.0的枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），200ml需350W修复5min3)对照： 阴性对照： 经过固定和通透的细胞样品加入50l试剂2以代替TUNEL反应混合物，从标记步骤以下同上。阳性对照： 经过固定
9、和通透的细胞样品用细球菌的核酸酶或DNase I使之产生DNA链缺口，从标记步骤以下同上。4)操作流程：常规脱蜡、脱水处理冲洗样品滴加TUNEL反应混合物，37孵育60分钟冲洗样品选择：荧光镜下观察分析滴加转化剂-POD，37孵育30分钟洗样品滴加DAB底物溶液，室温孵育5-20分钟光镜下分析结果5)假阳性多的原因有很多：POD封闭不全、DAB显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是DAB孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强PBS浸洗6)DAB显色时间:（1）DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（2）DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现
10、很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；（3）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（4）DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。7)脱片产生的原因和如何防止脱片:（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，迈新按说也是不错的，可是都脱成什么样子了。后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。（3）组织的问题，越是有坏死之类越容易脱。（4）没烤好，时间短温度不够之类。（5）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（6）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。
