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1、有机磷酸酯类中毒及解救Toxication and Detoxication of Organophosphates【目的和原理】 观察有机磷酸酯类（ organophosphates）中毒的症状，理解解救药阿托品、解磷定的解救作用及机制。掌握家兔耳缘静脉注射的方法。Organophosphates通过抑制胆碱酯酶（ cholinesterase，AChE）活性，使乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）在体内堆积，产生中毒症状。抗胆碱药阿托品能解除有机磷酸酯类中毒的 M样症状，而解磷定可复活 AChE，恢复其水解ACh的能力，对M及N 样症状均有效，以缓解骨骼肌震颤的效果最快，两药合用
2、可提高解救效果。【实验动物】家兔，体重2.53.0kg。【实验器材和药品】兔固定箱、测瞳尺、听诊器、注射器（5ml、10ml、20ml）、针头、兔耳夹、脱脂棉球、台秤、722分光光度计、恒温水浴箱、试管及试管架、加样器、 effendorff管、滤纸。10%美曲膦酯敌百虫( depterex)、0.05%硫酸阿托品（ atropine sulfate）、2.5%解磷定（pyridine aldoxime methiodide,PAM）、生理盐水（ saline）。【实验步骤和观察项目】1健康家兔5只 ，称体重，分为5组，分别为空白对照组（甲）、模型组（乙）、给解救药组：atropine组（丙）
3、、PAM组（丁）、atropine + PAM组（戊），观察并记录各组家兔的活动情况：呼吸（频率、幅度、肺呼吸音、有无呼吸困难，呼吸道有无分泌物等），瞳孔大小（ pupillary size），唾液分泌（ salivary secretion），大小便（ urination and defecation），肌张力（muscular tension）及有无肌肉震颤（muscle tremor）等。2将甲、乙、丙、丁、戊、五只家兔分别放于兔固定箱内，甲兔由耳缘静脉给予 saline（1ml/kg）；乙、丙、丁、戊兔分别由耳缘静脉缓慢注入depterex（1ml/kg），给药后密切观察上述指标的变化
4、并记录。待 M样、N样中毒症状均较明显时，乙兔不予解救药，使其中毒症状充分表现出来，如果死亡，分析死亡原因；丙兔耳缘静脉注射 atropine（2ml/kg），丁兔耳缘静脉缓慢注射 PAM（4ml/kg），戊兔耳缘静脉先 atropine（2ml/kg），而后注射 PAM（4ml/kg），观察中毒症状有何变化， atropine和PAM分别改善了哪些症状？3. 实验结果记录:一般 呼吸 心率 瞳孔 唾液 大小便 肌张力 肌震颤状态 次/min 次/min 大小 分泌给药前给敌百虫给阿托品给解磷定阿 + 解附：胆碱酯酶活性测定（ determination of activity of AChE
5、）【目的和原理】学习 AChE活性的测定方法 ,观察中毒前后及使用不同解救药后 AChE活性的变化。ACh在血液中被 AChE水解，产生醋酸和胆碱。在一定范围，水解的 ACh量与 AChE的活性成正比。故在反应体系中，加入定量的 ACh使之参加反应，通过测定剩余的 ACh即可计算出水解 ACh的量，从而推算出 AChE活性。ACh的呈色反应ACh可与羟胺反应生成乙酰羟肟酸，后者在酸性条件下与三价铁离子形成褐色的羟肟酸铁络合物，其颜色的深浅可反映 ACh含量。反应过程如下：(1)盐酸羟胺与氢氧化钠作用释放出游离羟胺NH2OHHCL+NaOHNH2OH+NaCL+H2O(2) 剩余 ACh与游离羟
6、胺作用，生成羟肟酸化合物（CH3）N(CH2)2OCOCH3+NH2OHCH3CONHOH +（CH3）3N（CH2）2OH(3)羟肟酸化合物在酸性环境中与三氯化铁生成褐色复合物（羟肟酸铁络合物）酸性 Fe/3FeCL3+CH3CONHOHCH3CONHO+HCL(棕红色)【实验药品】(1) 710-3mol/L氯化 ACh：取 ACh用蒸馏水配成 2.54溶液，冰箱保存。用前以蒸馏水 20倍稀释即成 710-3mol/L ACh溶液。(2) 1mol/L盐酸羟胺（ NH2OHHCL）：取 25g盐酸羟胺，加蒸馏水 359ml，冰箱保存。(3) 3.5N NaOH。(4) 4N HCL。(5)
7、 3.710-1mol/L三氯化铁（FeCL36 H2O ）：取 10g三氯化铁，加蒸馏水至 20ml，浓 HCl 0.84ml，加温溶解，最后加蒸馏水至 100ml制成 3.710-1mol/L三氯化铁（FeCL3 0.1N HCl）溶液。(6) PH7.2的磷酸缓冲液：取Na2HPO412H2O16.72g和KH2PO42.72g加蒸馏水至100ml，冰箱保存。【实验步骤】(1)家兔在给药前、中毒症状明显后、给atropine待症状明显缓解后、给予 PAM解救后0min、10min、20min、30min等时间点分别由兔耳缘静脉或股静脉取血0.5ml，测定 AChE活性。具体步骤见表 1。
8、(2)取 20ml试管若干个，按表加入磷酸缓冲液 0.851ml，血样 00.15ml，置 371恒温水浴中预热 35min。(3)加入 710-3mol/L ACh溶液 1.0ml（用加样器），于 371水浴中反应 40min，每隔 10min摇动一次。(4)反应 40min后立即加入碱性羟胺（ 1mol/L NH2OHHCL与 3.5N NaOH溶液在用前20min等容混合，并不断震荡）4.0ml。(5)依次加入 4N HCL和 3.710-1mol/L FeCL3各 2ml，每加入一种试剂都要充分振荡。(6)上述反应液均用滤纸过滤，将滤液倒入比色杯中，以 530nm的波长比色。(7)对照
9、管（标准 ACh值）：为反应体系中全量 ACh对照。空白管：为无血、无 Ach的其它试剂对照。对照管与空白管操作步骤同其它样品（见表）。以上操作顺序见表。【实验结果】1. 计算酶活性：全血 AChE活性值以 0.15ml全血在 40min内水解 ACh的mol数表示（mol/0.15ml/40min）酶活性计算：OD标准管OD测定管全血 AChE活性值 = 7OD标准管酶活性值百分数计算样本 AChE活性值100%正常全血 AChE活性值1绘制时效曲线根据给予 PAM解救后几个时间点的 AChE活性值制图。酶活性（）时间【注意事项】1. Depterex属于剧毒杀虫剂，且可从皮肤吸收，如与手等
10、接触后，应立即用清水清洗。2. 给家兔 depterex后，15min仍未出现中毒症状，可再追加 1/3剂量的 depterex溶液。3. 测定 AChE活性时，加入每种试剂时剂量一定要准确。【思考题】1. 有机磷酸酯类药物中毒有哪些表现？药物效应是否有个体差异？2. Atropine和 PAM可解除有机磷中毒的哪些症状和体征？有何不同？为什么？3. 使用 atropine和PAM解救后，家兔全血 AChE活性有何变化？表 AChE活性的测定步骤磷全水ACh蒸水碱性盐三氧化过OD AchE酸血浴 馏浴羟胺酸铁滤 活性缓水（%）冲液空白管 1.0 - - 4.0 2.0 2.0标准管 1.0 -
11、 1.0 4.0 2.0 2.0乙兔给药前 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.0中毒时 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.0丙兔31.0 1.0ml 40min 4.0 2.0 2.0给药前 0.85 0.15中毒时 0.85 0.151.0 4.0 2.0 2.0阿托品后 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.0戊兔给药前 0.85 0.15 5 1.0 4.0 2.0 2.0中毒时 0.85 0.15 min 1.0 4.0 2.0 2.0阿托品后 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.0PAM后0 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.010min 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.020min 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.030min 0.85 0.15 1.0 4.0 2.0 2.0注：1.上述所加溶液，均以 ml为单位。4. 过滤后的滤液在 15min内在 530nm波长下比色，以空白管调零，测定各管光密度值。（李晶） （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）
