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1、实验一、免疫扩散反应一、实验目的 1、了解免疫扩散反应的原理。 2、学习几种免疫扩散实验方法。二、实验原理可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性地结合，在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀物的一种免疫血清学技术。 （一）单向扩散实验一种定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。本实验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。（二）双向扩散实验抗原抗体在一定pH和离子存在
2、的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间后，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并继续扩散，当扩散至两者的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于扩散方向的免疫沉淀线即等价线。三、实验材料及设备1、抗体：羊抗人IgG单价抗血清（双流正龙，效价1:100）2、抗原：人的免疫球蛋白（双流正龙）3、琼脂、生理盐水、0.01mol/LPBS缓冲液 载玻片、自制打孔器、移液枪，培养皿4、0.05%氨基黑10B染色液称取0.5g氨基黑10B溶于500mL lmol/L乙酸及500mL 0.1mol/L乙酸钠溶液中。四、实验内容（一）单向扩散实验平板法 1、制备含抗体的琼脂板取3%生理盐水琼脂，
3、电炉加热使之溶解，然后置56水浴中，待琼脂温度降至56时，立即加入等体积已稀释一定倍数（40倍稀释）的羊抗人IgG抗体（混合前已在56水浴中预热），迅速轻轻混匀，勿使产生气泡，迅速倾入载玻片上，待凝固。（建议制片时多个载玻片放在一起同时到平板，琼脂板效果较佳） 2、稀释人的免疫球蛋白抗原（教师已做好） 将人的免疫球蛋白抗原用生理盐水作相应倍数稀释（1:101:80）， 3、打孔、加样 用自制打孔器打孔，如下图所示。（打孔时注意不要将孔打穿）抗原用10uL移液枪加抗原。加满（但不要溢出），加样时枪头尖端不要划破琼脂。 4、温育 将琼脂板置培养皿中，垫湿纱布或湿棉花以防干燥，37恒温箱保温24h。
4、（二）单向扩散实验试管法 1、取一试管，用1.0%生理盐水琼脂电炉加热使之溶，然后置56水浴中，待琼脂温度降至56时，立即加入等体积已稀释一定倍数的羊抗人IgG抗体（已预热至56），迅速轻轻混匀，勿使产生气泡，倒入试管，每支试管内混合后的溶液总体积约为3ml。 2、待试管中溶液凝固后，沿试管壁轻轻倒入体积约1ml稀释一定倍数的抗原。（注意：一定等试管中溶液完全凝固后再加抗原。） 3、将试管放入37恒温箱保温24h。（三）双向扩散实验 1、制备琼脂板取3%生理盐水琼脂一管，电炉加热使之溶解，迅速倾入载玻片上，凝固备用。 2、稀释人免疫球蛋白抗原、稀释羊抗人抗体（教师已做好） 将人免疫球蛋白抗原、
5、抗体用生理盐水作相应倍数稀释。3、打孔、加样用自制打孔器打孔，如下图所示。（打孔时注意不要将孔打穿了，由于抗原抗体量有限，所以中间孔与四周四个孔之间的距离不能太远。）抗原抗体抗体抗原4、温育 将琼脂板置培养皿中，垫湿纱布或湿棉花以防干燥，37恒温箱保温24h。五、实验要求 1、根据实验具体情况至少选做其中一种方法 2、掌握本实验的原理，了解实验在实际中的作用 3、完成实验报告，并回答指导老师实验中提出的问题。实验二 凝集反应（血型鉴定）一、目的要求了解血型鉴定的原理，掌握其鉴定方法。二、原理 人红细胞膜上有ABO血型系统的凝集原，血浆内含有非应对的凝集素。当相应的凝集原、凝集素相互作用时，就产
6、生红细胞的凝集。可依次用标准血清判定被测定人红细胞上凝集原的类型，即血型。三、材料1. 标准血清：标准A及B型血清。2. 刺血针及酒精棉球，载玻片。四、操作方法1.取一干洁双凹玻片，在左、右上角标好“A”“B”字样，分别滴入抗A抗B标准血清1滴。2. 人指尖采血消毒，待酒精挥发后采血。用干洁玻片两端各取一滴血分别与一种标准血清混匀，室温下静置几分钟观察。3. 观察判定：如果红细胞聚集成团，虽经震荡或轻轻搅动亦不散开，为“凝集”现象；红细胞散在均匀分布或虽似团，一经震荡即散开，则为未凝集或“假凝集”。按下表判定血型不同血型检查结果标准A型血清(内含凝集素)标准B型血清(内含凝集素)血型O+-A-
7、+BAB注：“+”为凝集，“”为不凝集。五、实验报告回答实验课上老师提的三个问题实验三、酶联免疫与免疫反应试验一、实验目的1、了解酶联免疫吸附实验原理；2、学会用酶联免疫方法对抗原或抗体进行检测；3、初步了解ELISA实验方法的实际应用。二、实验原理 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶的反应底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。
8、三、实验用品（一）器材：酶标板、洗扳机、37温箱、40孔聚苯乙烯板、微量加液器（二）试剂:1、抗原：人血清抗原（北京博奥森生物技术有限公司）2、一抗：兔抗人抗体（北京博奥森生物技术有限公司）3、二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白(IgG) （北京博奥森生物技术有限公司）4、包被液（碳酸钠0.7493g、碳酸氢钠1.4625g、调pH9.6，定容至500mL，过滤除菌）5、稀释缓冲液（PBS：十二水磷酸氢二钠7.1626g，氯化钠15.9966g，氯化钾0.3997g，磷酸二氢钾0.4003g，加水至2000mL，调pH7.4。）6、洗涤缓冲液7、封闭液8、显色底物溶液9、2M H2SO4
9、。四、实验步骤1. 包被：将人血清抗原，在酶标板反应孔加50uL/孔，具体如图表1，至37恒温保温箱保温2小时（可直接使用或包被后4过夜），次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次。2. 封闭：每孔加200uL，37保温1小时（或包被后4过夜）, 空干弃去残渣，洗涤3次。3. 加一抗：一抗（兔抗人抗体）每孔加200uL，37保温1小时, 空干弃去残渣，洗涤3次。4.加二抗：每孔加200uL，37保温30分钟, 空干弃去残渣，洗涤3次。5.加显色底物：各孔加100uL显色底物，暗处显色520min。6.反应终止液：各孔加100uL反应终止液，室温下待颜色稳定。7.测值：酶联检测仪（492nm）读取的OD值，可直接作为ELlSA结果报告。五、实验报告处理数据，作标准曲线。
