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1、生命科学前沿讲座论文转基因食品的检测方法姓名：陈继款系另I：生命科学学院专业：生物信息学年级：2008级学 号：080567011指导老师： 薛李春总成绩：2010 年 07 月02 日转基因食品的检测方法自 1983 年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到 5 000 万 hm2 以上， 大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。但是转基因作物作为一种新物种， 其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。 我国于 2001 年 5 月 23 日颁布农业转基因生物安全管理条例，2002 年 3
2、 月 20 日开始实行的农业转基 因生物标识管理办法规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。世界各国均对转基因食品及 其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。因此转基因产品的检测就显得尤为重要。转基因食品的检测 主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通 过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主 要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且 被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测
3、方法进 行综述。1 核酸水平主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。椰菜花叶病毒(CaMV)35s启 动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提 供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。1 1 定性检测1. 1. 1聚合酶链式反应(PCR)1996 年德国伯恩斯坦大学的 Meyer Rolf 等论证了 PCR 检测转基因食品的可能性。利用该方法在鉴定转 基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Bt 176 Maxi maizer的实验 中，可以检测
4、到仅为0. 5%转基因成分。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设 计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转 基因大豆、非转基因大豆进行了 PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大 麦、小麦等进行了 PCR 扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。每一次实验均需要 设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。1. 1. 2 多重 PCR多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具
5、 有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。多重PCR可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。 V. T. Forte等利用其设计的多重PCR方法对转基因大豆和Bt玉米样品进行实际检测，结果表明该方法能够 准确的检测食品中是否含有转基因成分，其检测结果可以精确到2%0.1%的范围。Permingeat等仅用两 对引物就可同时检测出转基因玉米Bt 176、M0N810、Btll和T25的CrylA(b)和pat基因。多重PCR也可同 时准确地扩增出 Roundup Ready 大豆的 NOS 和 epsps 序列片段。113 巢式和半巢式 PCR(nested PCR and semi-ne
6、sted PCR)巢式PCR(nested PCR)是在普通PCR基础上发展起来的一种PCR技术。其原理是设计两对引物，其中一 对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次PCR反应对某个基因进行检测。1. 1. 4 核酸印记法(southern blot)以放射性或荧光标记的外源目的基因的同源序列作为探针与该食品原料农产品的总DNA进行杂交。首先 用限制酶消化受体总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳按大小分离所得的片断，随后使DNA在原位发生变性，并从 凝胶转移至一固相支持体上。DNA转移至固相支持体的过程中，各个DNA片断的相对位置保持不变，用放射 性或荧光标记的探针与各个DNA片断杂交，经放射自
7、显影确定与探针互补的电泳条带的位置。核酸印记法技 术用于食品外源基因的检测可检测出外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品 的纯度要求较高，费用也较高。1.2 定量检测1 . 2. 1 竞争性 PCR通过比较要扩增的样品中目标DNA和在同一体系中进行扩增的已知量的竞争性DNA而得到的,竞争性DNA 必须与目标 DNA 具有相同的引物和不同的分子量，以便二者既能同时进行扩增反应又能使扩增后的两种产物 通过凝胶电泳区分开来。Anastasia k等在竞争性PCR的基础上，对双竞争性定量PCR(Double cmantitative competitivePCR, DCPCR
8、)进行了研究，并与实时PCR进行了比较，证明竞争性PCR具有灵敏度高、探针价格 更低廉的优点。1. 2. 2 实时荧光定量 PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR) 这是在转基因食品检测中非常重要的一种检测技术。在该体系中，除了两条普通的引物外，还有一条在 5和3端分别标记了报告荧光染料基团(R)、粹灭荧光染料基团(Q),并与PCR产物特异片段结合的寡核苷 酸探针。荧光染料也有报道用SYBR Green021。陈颖等利用该方法对转基因玉米Mon 810和Event 176的定 量检测低限均小于0. 01%031。刘冰峰等利用该方法对转基因烟草K3
9、58进行了检测。它通过分析起始拷 贝数的方式以标准品制备标准曲线，从而判定待检产品中的转基因含量。在整个检测过程中闭管操作，使用 荧光染料特异标记PCR产物，实时显示PCR产物的动态积累，且没有繁杂的后续处理过程，避免了产物的污 染，方法快捷、灵敏、有效。1. 2. 3多重荧光PCR多重PCR和实时荧光定量PCR的结合，刘光明等利用该技术对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄共11份 实物样品进行检测，结果显示马铃薯样品2份及大豆、玉米、甜椒样品各l份中检出35S和Nos双组分，另 6 份样品均未检出。2 蛋白质水平上的检测2. 1蛋白质印迹法(Wes tern blo t)蛋白质印迹法将电泳较高的
10、分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来，是检测复杂混合 物中特异蛋白质的最有力的工具之一。普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质，灵敏度为1 ng5 ng。它可 确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别用于不可溶蛋白质的分析。 vanDuijn 等用蛋白质印迹法检测 Roundup Ready 大豆中的 CP4 合成酶，检测限在 05一 1。验证该方法可对大豆 蛋白质产品进行检测。2. 2 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)Rogan等用ELISA法检测出传统大豆加工产品中混有2 % Roundu
11、p Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白质。这 种蛋白质检测方法具有商业可利用性并具有高度选择性和灵敏性。免疫测定的主要缺点之一是复杂基质对它 的准确性和精确度有干扰，如加工的蔬菜和食品。某些导入蛋白质并不是在植物的所有组织中均有表达，例 如在玉米中一些蛋白质大部分表达在叶子中，而不在谷粒中。3 其它检测方法 随着国内外对转基因产品检测研究的深入以及各国对转基因产品检测要求的提高，迫切地需要更准确、快速、安全、高效且成本低廉的检测技术的问世。除了上面介绍的方法外，还有一些其它的检测方法。目前， 色谱技术(HPLC)、近红外波谱技术(NIR)、毛细管电泳技术(CE)、超分支滚环扩增技术(HR
12、CA)以及基于一些成 熟技术建立起来的试剂盒技术、试纸条技术在转基因食品的实际检测中都有所应用。4 结束语 转基因食品的检测方法多种多样，各有其优缺点。在实际的检测中，并非任何一种检测方法对某种转基因食品的检测都行之有效。应该根据食品种类和加工类型的不同，以及食品中可能含有的转基因片段的不同， 选择最有效的检测方法。同时，现有的检测方法也在不断的改进中，随着各国有关转基因成分标签法的建立 和不断完善，对转基因成分的准确定量检测显得日趋重要。这就要求，转基因食品的检测方法向着高质量、 高灵敏度、高准确性、自动化和低成本的方向发展。转基因产品检测仪器 转基因产品的检测，就是检测产品中有否外源基因，
13、其实是检测启动子、终止子、标记基因片断、目的 基因片断、外源基因转录产物的丰度等。就方法而言，又分为基因水平的检测(各种 PCR 扩增、定性、定量 方法和基因芯片技术)和基因转录水平检测(酶联免疫吸附反应技术、蛋白芯片技术以及Sou then杂交West ern 印迹法等)，主要使用仪器按检测程序分三部份：1、用于 DNA 样品制备的仪器设备：试剂盒、微量移液器、离心机、振荡器、水浴锅等。2、用于基因扩增的仪器设备：定性PCR扩增仪以及混合液，保真DNA聚合酶，试剂盒等。3、分离、分析、检定的仪器设备：核酸电泳系统、成像分析、核酸(蛋白)测定仪、自动电泳分析系统、酶 标仪、洗板机、定量 PCR 等。这些仪器设备国外著名厂家是 BI0-RAD、 Thermo-Life Sciences、 GE 等；国内尚无完整生产上述仪器的 厂家，这也是一个缺陷。
