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1、利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体-青蒿酸Dae-Kyun Ro1*, Eric M. Paradise2*, Mario Ouellet1, Karl J. Fisher6, Karyn L. Newman1, John M. Ndungu3, Kimberly A. Ho1, Rachel A. Eachus1, Timothy S. Ham4, James Kirby2, Michelle C. Y. Chang1, Sydnor T. Withers2,Yoichiro Shiba2, Richmond Sarpong3 & Jay D. Keasling1,2,4,5（杨豫鲁翻译）
2、摘要：疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，并且每年杀死超过一百万的人口。抗药 疟原虫突变系 Plasmodium falciparu2m,3 的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。虽然人工 合成的抗疟药以及相关疫苗已经出现，但其针对疟疾的治疗效果仍需经受严格的临床检验 4， 5。而青蒿素，一种从 Artemisia annua （L 菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯 环内过氧化物（C-15倍半萜），对抗药性疟原虫Plasmodium spp的抑制效果非常明显。可 惜的是其供给量受自然因素等各方面限制，疟疾患者大都难以承受其昂贵的价格 6。青蒿素 的人工全合成也非常困难，而且花费很大
3、 7。不过利用微生物工程发酵合成其前体青蒿酸（一 种合成青蒿素的可靠来源） ,却是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法 8，9。这里我们 将介绍如何通过基因工程途径改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可达100ug/L）:对 其甲羟戊酸途径进行调控，并且转入编码amorphadiene（等价于amorpha-4,ll-diene，合 成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料）合酶和一种特异的细胞色素P450酶（CYP71AV1）的 基因。这两种酶均源自青蒿，而且后者经过三步氧化作用将 amorpha-4,11-diene 转变成青 蒿酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并附着在酵母外表面上，这意味着通过简
4、单且廉价的纯化 过程就可以获得目标产物。尽管这种基因工程酵母合成青蒿酸的能力相对于青蒿来说已经十 分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规模生产，以便可以生 产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综合疗法可以广泛地被应用到对疟 疾的治疗中去。内容:我们通过三个步骤构建能合成青蒿酸的基因工程酵母:（ 1）改造酵母焦磷酸法尼酯 （FPP）生物合成途径中的相关基因，增加FPP的合成并且设法减少它作为固醇类物质的前 体去合成固醇；（2）将青蒿中的amorphadiene合酶基因ADS转入到高FPP生产株中，从而 转化FPP为amorphadiene； （3）克隆青蒿中
5、特异的细胞色素P450酶基因（这种酶通过三步 氧化将amorphadiene氧化成青蒿酸）并使其在amorphadiene生产株内表达（见图1）。青 蒿素生物合成的第一步反应由 ADS10 催化， 它已经被鉴定并且用于在大肠杆菌Simple sugar*糖酵解途径飓缈朋乙酰辅執ERG偏解酶Acetoacety!-CoA 乙醜乙酰丄 ERG13ADS； Amorphadiene-5CYP71AV1：细胞色素P450酶的一种，三步:CPR细胞色素P450氧化还原酶CYP71AV1 的辅助酶Amorpha-4,11-diene152 H =ADS 3414HMG-CoA -嶷基-0 -田基戊二醜辅爾
6、盘2x tHMGR _HMGCoAjJ 原爾Mevalonateg甲基戊酸：MVA)ERG12Mevalonate-P5_WvAERG8Mevaonate-PP5_#KMVAI ERG19IDI1畀戈烯焦IPPDMAPP磷酸酯图1|图中所示15H11riCYP71AV1/CPR异构Non-enzymatic HHH0H013CYP71AV1/CPRHOCYP71AVVCPR显示的是啤酒酵母甲羟戊酸合成途径中被直接正调节的224中被抑制P71AV1和CPR的基因工程啤酒酵母菌株EPY224中青蒿酸的合成途径。蓝颜色h e Artennisinic acid显示的是因UPC2素表达被间接正调节匸同
7、作用下经过三步氧化将的基因；红线指示菌株EF这条途径已经从青蒿被完amorphadiene转变为青蒿酸。途径中间产物翳 MAPP和GPP分 酸酯和焦磷酸牻牛儿酯。*Squ护ne鲨烯J 的 ER(9；焦磷酸法呢酯到青蒿酸的生物合成途;|入到啤酒酵母当中,在CYP71AV1和径,I代表异戊烯焦磷酸酯、二甲基丙烯焦磷Semi-synthesis半答成中合成amorphadienei。为了确定对是否要促进细胞内fpp的合成,我们将ads基因插入由gali 启动子控制转录的PRS425质粒中，然后在酵母细月表达，结果显示单独转入ADS基因的酵中HH宣言素母只合成少量的amorphadiene （图2,
8、菌株EPY201, 4.4mg/L）。图2 |柱状图显示基因改造过程不同阶段啤酒酵母菌株的amorphadiene合成能力，这些菌株的详细介绍请 见正文。为减小实验误差，均在同一条件下培养144小时后取样测定，amorphadiene合成水平也被定量化。 纵坐标表示总产量，为平均值土标准差（n =3）。hBIU) 心纭巧dQlu所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我们对FPP合成途径进行了总共五 次的基因工程改造。几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成 固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修 饰都是通
9、过染色体融合进行的。具体过程如下：首先，将一种截短的水溶性酶3-羟基-3-甲 基-戊二酰辅酶A还原酶（我们所学生化书中为译为0 -羟基-0 -甲基-戊二酰辅酶A还原酶， 简称HMGCoA还原酶，又简称t HMGR12，是固醇合成的限速酶）过表达，可提高amorphadiene的 合成产量近五倍（图2，菌株EPY208）；其次，利用一个methioninerepressible启动子 （PMET3）13，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中FPP合成后第一步）的ERG9基因进行 负调控，可将amor phadiene的合成量再增加两倍（图2，菌株EPY225）；然后，尽管Upc2-1, 一个可
10、以加强UPC2 （啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子）14活性的半显性突变 体等位基因，在已有菌株EPY208背景下过表达（图2，菌株EPY210）对amorphadiene合成的 提高起的作用并不显著，但结合对ERG9基因的负调控，其过表达可将amorphadiene的合成量 提高到105mg/L （图2，菌株EPY213）；再次，在酵母染色体更远处在转进一个tHMGP拷贝可 以将将其合成量再增加50%达到149mg/L （图2,菌株EPY219）；最后，虽然编码FPP合酶的 基因（ERG20）过表达对amorphadiene合成总量（图2,菌株EPY224）的提高效果非常小， 但在
11、细胞密度降低的情况下其合成量却可增加10%。将所有这些对基因的修饰综合在菌株 EPY224上, amorphad iene的合成量已经达到了 153mg/L ,是之前所报道这种倍半萜（烯）最 大合成水平的几乎500倍15。（王易龙翻译）现在我们已经得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株，但为能将amor phadiene 转变成青蒿酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化amorphadiene转变成青蒿酸的酶的 基因。青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物，这些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一类十分有 特性的细胞次级代谢产物。我们假定菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步中利用的是源 于同
12、一祖先的合成酶，据此对菊科植物进行了一次基因组比较分析。由于先前已经有文章报 道过对青蒿的无细胞化验，并且证明在青蒿中是一种特异的细胞色素P45 0酶17对amorphadie ne进行专一性羟化（图1）。我们直接从由向日葵和萬苣这两种菊科作物提供的基因数据构 建的已表达序列标志（EST）数据库中检索得到细胞色素P450已表达序列标志（ESTs）。然 后通过使用针对CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的两个家族）高度特异的简并 引物，从青蒿毛状体细胞的互补DNA库中分离出几个特定的P450片段。接着利用BLAST分析法 18将这些片段与向日葵和萬苣的ESTs比对，我们惊奇地发
13、现有一个青蒿P450基因片段与来自 以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸水平上达相似度达85-88%），而同其他 非菊科植物的P450序列相似度较低（氨基酸水平上小于50%）。这表明相对于非菊科植物， P450基因在这三个亲缘关系较远的菊科植物属中是高度保守的。因此，从青蒿中分离出的这 段P450基因是编码菊科保守性倍半萜内酯生物合成酶一个非常好的候选者。随后相应的完整P450cDNA （CYP71AV1），一个编码495个氨基酸的开放阅读框，成功从 青蒿中分离获得。系统进化分析法显示CYP71AV1和其他的P450s （像催化类单萜羟化的CYP71 D13/1819、催化倍半萜
14、羟化的CYP71D202。以及二萜类化合物羟化的CYP71D1621）有很近的亲缘 关系。这进一步表明从青蒿中获得的P450在萜类化合物代谢中存在的潜在作用。为了保证异 源表达的CYP71AV1可以发挥正常功能，协同它进行氧化还原反应的天然配体，NADPH：细胞 色素P450氧化还原酶（CPR），同样从青蒿中成功分离，并且其生化活性已经在体外被证实。 （细胞色素c和NADPH 的米氏常数（Km）分别为4.30.7 p M和23.04.4 p M （平均值 土标准差，n =3 ）。在配体分子CPR的参与下，我们研究了在活细胞体内CYP71AV1是否可以催化amorphadie ne转变为多级氧化
15、产物：转基因酵母株EPY224中被转入了一个整合有CPR和CYP71AV1基因并 且由半乳糖诱导启动子调控的基因载体，经半乳糖的诱导表达后，用醚对酵母细胞体和培养 基分别进行抽提，并对馏分进行气象色谱一质谱联合分析（GC-MS）。分析结果显示，在同时 表达CYP71AV1和CPR的细胞株EPY224细胞体及其培养基中，一个独特的单色谱峰被检测出， 但是在只表达CPR的EPY224中并未检测到这个峰，并且，几乎95%的这种特异化合物是来源于 细胞体的。而且这种化合物的电子碰撞质谱和保留时间与从青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合 （图3）。在摇瓶培养条件下，同时表达CYP71AV1和CPR的EPY224菌株青蒿酸产量为32 土 13 mg/L （平均数土标准差，n=7）。更为重要的是，其中间代谢产物，青蒿醇和青蒿醛在细胞 体和培养基中被检测到的量几乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的5%还少，并且根本没有 青蒿醛被检测出）。我们证实，通过用碱性缓冲液（pH为9的Tris-HCL缓冲液中添加1.2M的山梨醇）清洗 胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿酸（
