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1、异黄酮类化合物精制方法的研究现状异黄酮类化合物是一类具有植物雌激素活性、增强机体抗氧化能力、提高免疫机能以及抗癌等多种功效的生物活性物质，很具有开发价值，近年来成为国内外的研究热点。目前，国内对于各种植物中黄酮和异黄酮类化合物的提取和精制工艺研究较多，但将其应用于工业化生产仍存在一些问题，主要有以下两点：高投入，低产出，导致成本过高。表现在生产耗时长、耗能高、污染环境方面；由于仪器设备条件有限，国内产品的质量（主要指高纯度和安全指标）难以达到要求。因此，要得到质优且成本较低的异黄酮产品，仍需对其生产工艺进一步研究和探索，以找到一套更适合于工业化生产、更高效的生产工艺。本文对异黄酮类化合物的几种
2、主要精制方法的各自特点和应用情况进行综述，希望为研究者提供一些研究基础和参考。1 异黄酮类化合物的来源、结构、种类和理化性质异黄酮类化合物主要存在于豆科植物（如大豆、红三叶草、野葛）中，目前已经发现的有几十种。这是一类以3-苯基苯并吡喃酮为母体的多羟基酚类，由于其结构与雌二醇相似，故称为植物雌激素。不同来源的异黄酮化合物的主要成分和含量也有所不同。按结构划分，异黄酮类化合物主要有3类：葡萄糖苷配基、葡萄糖苷、酰基化葡萄糖苷，在植物中主要以后两种形式存在，少量以游离配基的形式存在1，2。研究表明，这3种类型中以葡萄糖苷配基的生物活性最高。异黄酮类化合物易溶于丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等极性溶剂中
3、。在水溶性上，与其结构有关，游离形式的配基水溶性最差，基本不溶于水；葡萄糖苷和酰基化葡萄糖苷一般易溶于水，但同是葡萄糖苷的染料木苷却难溶于水，水中的溶解度在450 时无明显变化；在7090 时其溶解度随着温度的升高而显著增加。因此，在用水溶液提取异黄酮时，温度应超过70 。酰基化葡萄糖苷在加热和碱性条件下可以水解去掉酰基而转化成葡萄糖苷。碱水解的pH值为813，水解程度随pH值及温度的升高而加大。葡萄糖苷在强碱、高温或酶存在的条件下可水解去掉葡萄糖基而转变成葡萄糖苷配基形式3。2 异黄酮类化合物的精制方法2.1 吸附法大孔树脂吸附法是吸附法精制的代表，也是目前对总异黄酮进行精制使用的最广泛也较
4、为有效且环保的方法。其工艺流程为：浸提液吸附树脂吸附解吸干燥。其中浸提液吸附前需初步除杂（如脱脂、脱色、除蛋白、澄清处理等），吸附树脂需进行乙醇溶胀，并用稀酸及稀碱洗去残留有机物的预处理。此工艺是采用吸附树脂吸附浸提液中的大部分异黄酮类化合物，去除浸提液中的蛋白质、单糖、多糖及其它物质，从而起到精制作用。树脂吸附后用解吸液进行解吸，将解吸液干燥后即获得产物。很多研究者用树脂吸附法对不同来源的异黄酮粗提物进行精制试验发现，纯度均有不同程度的提高4-7。刘国庆5等（2004）在对大豆乳清废水中异黄酮吸附影响因素的研究中表明，采用了梯度洗脱和二级吸附工艺发现，只采用“纯水淋洗8%乙醇淋洗80%乙醇洗
5、脱”的梯洗工艺可使纯度由一次洗脱工艺的8.8%增至14.5%；结合二级吸附工艺，即将梯洗所得洗脱液浓缩至醇含量低于5%，加水稀释后再次上柱吸附，则可使纯度增至42%以上，回收率在75%以上（以染料木素为对照品的紫外分光光度法测定）。蒋永红6等（2002）在对大豆异黄酮提取分离工艺的探索中，使用D101-A型大孔树脂进行纯化，采用“吸附水洗20乙醇淋洗80乙醇解吸”的工艺发现，水洗和20醇洗所损失的异黄酮量小于5，而在解吸液中异黄酮高达94.34，解吸液与上柱物料相比，异黄酮含量增加了10倍以上，达8.23（以大豆苷元和染料木素为混标的HPLC法测定）。李崇明7（2004）在对红车轴草异黄酮的精
6、制研究中也采用此方法，得到了较满意的结果。由于大孔吸附树脂价格较低且可重复使用，易再生，纯化效率及得率较高，污染小，操作不复杂，故此法具较强推广性。弊端是大孔吸附树脂作为化工产品存在有机物残留的问题，故此法精制的异黄酮现不允许作保健食品用。另外，此法作为工业化生产的方法效率还是偏低。2.2 超滤膜法超滤是根据纯化的目的物和杂质的分子大小选择一定的膜孔径，在一定的压力和温度下，控制透过速率使目的物通过，截流住大分子的杂质，从而达到分离纯化的目的8。单纯采用超滤膜法精制异黄酮的纯度不够理想，通常将其与其它方法（主要是树脂吸附法）结合使用，利用其去除部分杂质，减轻了吸附树脂的负担，对提高纯度大为有利
7、3。但受实验条件限制，超滤膜法应用较少。2.3 溶剂提取（萃取）法异黄酮类化合物在一些有机溶剂中溶解度较大，所以可以通过高温浸提或常温萃取分液对其进行精制。此法相对应用也较广泛，溶剂法的弊端在于耗费大且操作过程中有不同程度的污染。2.3.1 乙酸乙酯萃取法乙酸乙酯是提纯精制异黄酮类化合物的常用溶剂。刘晶莹9等(2003)采用乙酸乙酯-水相萃取法对大豆异黄酮粗提液进行精制，可得到纯度为40.6%的产品(以三波长紫外分光光度法测定含量)，比精制前提高了30多个百分点。谷克仁10等(2003)将大豆异黄酮粗提液在盐酸中水解，再以乙酸乙酯萃取，发现最终产品纯度较高，但收率甚低，且产品外观差。此法是溶剂
8、法中的常用方法，对改善异黄酮的纯度也较为有效。2.3.2 丙酮提取及其与其它方法相结合异黄酮类化合物在丙酮中的溶解度较大，尤以大豆黄苷为主。经过树脂吸附的异黄酮化合物再以丙酮提取，可进一步提高纯度。且由于皂甙不溶于丙酮，可由此除去皂甙。阎祥华11等（2001）在大豆异黄酮提取工艺研究中，采用以下工艺：脱脂乙醇提取丙酮提取硅胶吸附丙酮浸提、蒸发再乙醇提取HCl水解蒸干乙醇中结晶。HPLC测得提取样中含染料木苷93.6、大豆苷2.68，总异黄酮含量达96.28%。可见，此工艺对单项异黄酮染料木苷的精制效率相当高，可以用于染料木苷的分离提纯。2.3.3 正丁醇萃取法异黄酮提取物中主要杂质是可溶性糖，
9、其在正丁醇中溶解度很低，而极性比糖小的异黄酮类化合物在正丁醇中有很好的溶解度。正丁醇-水相萃取法正是利用这一性质进行分离纯化的。谷克仁10等（2003）在对大豆异黄酮的纯化实验中发现，利用此法萃取，异黄酮在水相仍有较大溶解度，且正丁醇除糖不彻底，导致最终产品得率和纯度均不理想。且正丁醇在水中溶解度为14%，这部分溶剂难以回收，造成溶剂消耗。故此法虽理论可行，但实际效果还有待进一步验证。2.3.4 乙醚萃取法与水解法联用由于植物中的异黄酮主要以糖苷形式存在，因具有一定的极性而易溶于甲醇、乙醇、正丁醇等极性溶剂，难溶于乙醚等非极性溶剂。使用乙醚萃取的前提是将极性的异黄酮糖苷转变成非极性的苷元，故乙
10、醚萃取法需与水解法相结合。汪海波12等(2003)以脱脂大豆粕为原料，采取酸水解后用无水乙醚萃取法提取异黄酮苷元，结果表明，粗提品纯度达10.2%，提取率为48.9%(以染料木素为标样的紫外分光光度法测定)。2.3.5 组合溶剂回流提取法 贾乃堃13等（2004）在制备高纯度大豆黄苷的研究中采用了组合溶剂回流提取法，即将含总异黄酮37%的粗品先以丙酮在沸点下回流提取，取滤液干燥，所得固体再以乙酸乙酯沸点回流提取，得滤渣干燥，再将此产物经丙酮沸点回流，取滤渣干燥得产物，其中含大豆黄苷（D）89.6%、染料木苷（G）2.29%，收率40%。较原料的含D 25.46%、G 9.30%相比，D含量有大
11、幅提高，但G含量降低，总异黄酮含量也有提高。表明此法可以用来精制异黄酮单体，虽然没有逆流色谱法制备的纯度高，但由于不需特殊仪器，也是一种可取的方法。2.4 重结晶法与其它几种方法的联用对于含少量杂质的固体样品，最有效的纯化方法是选用适宜的溶剂进行重结晶，以分离除去杂质。其过程为：选择重结晶溶剂加热熔解趁热过滤冷却结晶抽滤干燥。重结晶法的弊端是得率甚低，尤其是当结晶原料中含量较低时，故此法需在其它方法的基础上使用，即使样品纯度已有一定的提高后再使用此法进一步精制。另外，重结晶的操作较难把握，无论对溶剂的选择还是溶解、过滤、结晶过程中的温度变化的控制，都需掌握好才能得到高纯度的晶体颗粒。刘晶莹9等
12、（2003）在对大豆异黄酮的精制工艺研究中，采用水解法-重结晶法联用和溶剂法-重结晶法联用，试验结果表明，增加重结晶的步骤使得产物纯度由单纯水解的10.12%和溶剂萃取的40.6%分别提高至34.2%和68.6%(三波长紫外分光光度法测定)。战宇14等(2006)在对粤蛇葡萄黄酮化合物的纯化研究中采用以水为溶剂的重结晶法，通过5次重结晶，黄酮纯度由粗品中的51.6%升高至97.47%，其得率随重结晶次数呈线性降低，5次后得率为41%（以芦丁为标准品紫外分光光度法测定）。可见重结晶法精制效果显著。2.5 色谱法以上各种方法，一般用于总异黄酮的精制，色谱法则主要用于分离制备单一的异黄酮化合物15，
13、主要包括制备型高效液相色谱法、逆流色谱法。制备型高效液相色谱法处理样品量太小，一般为数10 mg量级16,应用较少。高速逆流色谱(HSCCC)是一种不用固态载体的液液分配色谱技术，能实现连续有效的分配功能，现已在天然药物化学成分、天然产物的分离制备等方面得到大量的应用。其基本原理是根据被分离的物质在两相溶剂系统中的分配系数不同而得到最终分离。由于不使用固态载体，可避免分离样品与固态载体表面发生化学反应而导致的化学变性、有机物的吸附污染等现象，并且被分离的样品成分具有高回收率。江和源17等（2004）采用高速逆流色谱法分离纯化大豆异黄酮中的大豆苷和染料木苷，溶剂系统为乙酸乙酯-醋酸-水，体积比为
14、5：1：10，上相为固定相，下相为流动相，逆流色谱仪转速为800 r/min，流速为1.5 ml/min,所得大豆苷、染料木苷经高效液相色谱分析测定，纯度分别达到98.2%和99.2%。高速逆流色谱法由于具有分离容量大、性能强、高效、快速的优点，是大规模制备异黄酮类单体化合物较为便捷有效的方法，缺点是仪器设备昂贵，需要选用复杂的溶剂体系。2.6 其它方法精制异黄酮还有其它方法，如水解法、离心法18虽也用于异黄酮的精制，但一般不单独使用，而是作为提取精制过程中的一个步骤。3 结束语不同来源以及不同结构的异黄酮类化合物按照不同的目的需要采取不同的精制方法。且同一精制方法使用不同的检测方法所得到的结果也会有差异，所以还应形成一套相对较精确、偏差小的检测方法。由于现有的精制方法都存在这样或那样的不足，所以需要结合各种方法的优缺点，进一步完善和发展异黄酮类化合物的分离纯化工艺，以找到更高效的精制方法。
