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1、铵态氮（靛酚蓝比色法）III方法与原理：土壤浸出液中的nh4+在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性 染料靛酚蓝,溶液的蓝色很稳定，在NH4+-N浓度为0.050.5mg.L-i范围内，其深 浅与nh4+-n含量呈正比.试剂：1. 酚溶液：10g苯酚和100mg（0.1g）硝普钠（剧毒）【Na2Fe（CN）52H2O】一 1L 水暗瓶存于4C冰箱2. 次氯酸钠碱性溶液：10gNaOH,7.06gNa2HPO4 7H2O,31.8g Na3PO4 - 12H2O和10 ml次氯酸钠【w（NaOCl）=5.25%】一 1L水中 暗瓶存于4C冰箱3. 掩蔽剂:酒石酸钾钠溶液【p （KNaC4
2、H4O6 - 4H2O） =400 g.l-1与EDTA二 钠盐溶液【C10H14O8N2Na2】100 g.l-1等体积混合.每100 ml混合液加入0.5 mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂酒石酸钾钠【KNaC4H4O6 - 4H2O】 400g I EDTA 二钠盐【C10H14O8N2Na2 2H2O】 110.7 g稀释至2L.每100 ml混合液加入0.5 mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮 的掩蔽剂4. 【p （NaOH）】=10 mol.l-1 :400g NaOH 用蒸馏水定容至 1L5. NH4+-N标准液：0.4717g烘干的（NH4）2SO4
3、-1L水中（定容）此为NH4+-N 贮备标准液。测定当天将此液用蒸馏水水准确稀释20倍（如5ml稀释至100ml）即为 NH4+-N 标准液【p （NH4+-N） =5 mg.l-1】操作步骤：1. 土壤30g置于150ml三角瓶中加入100 ml 2M KCl浸提，振荡（140rpm）30min 过滤（约30ml以上滤液）2. 10 ml 样液于 50ml 容量瓶+约 20 ml 水+5 ml 酚+5 ml NaOCl摇匀，在20C左右置1小时I 1ml掩蔽剂以溶解沉淀物 定容50 ml入=625nm 比色3. 0/0.5/1/2/3/4/5ml NH4+-N 标准液于 50ml 容量瓶 +
4、10 ml KCl+约 20 ml 水+5 ml 酚+5 ml NaOCl摇匀，在20C左右置1小时后加入1ml掩蔽剂以溶解沉淀物定容50 ml入=625nm比色注意事项:掩蔽剂应在显色后加入，加入过早，会使显色很慢。加入过晚，易生成氢氧化物沉淀可能老化而不易分解，20C左右置1小时即可加入掩蔽剂0 ml0.5 ml1 ml2 ml3ml4 ml5ml!0 mg.L-10.050.10.20.30.40.5计算结果：p *V*ts*10-3W （N） =m*1000W （N） -土壤中铵态氮（NH4+-N）的质量分数，mg.kg-1 p -从工作曲线中查的显色液中氮的浓度，mg.l-1V-显色
5、液体积，ml （50 ml容量瓶）ts-分取倍数（100/10）10-3-将ml换算成L的系数m土壤质量，g1000-换算成每kg 土含量实验内容四：土壤微生物DNA的提取及鉴定（8学时）1. 称土样约0.3g于2ml离心管中，加入1.5ml溶菌酶液（解冻2小时，夏天）， 混合均匀，并在37C水浴锅中放置1h，每10min轻轻的摇匀一次，上下颠倒 30下左右（拿出pro-k解冻）2. 接着在液氮中放置4min （或高速振荡器6000rpm，45s）和65C水浴锅中放 置3min，循环3次3. 冷却全室温后，加入15ul pro-k （分装20ul，应先在振荡器振荡一下，再short 一下）和
6、75ul 10% SDS，55-60C下培养 1h，6000rpm 离心、5min4. 切掉枪头的tip尖端，提取上清液于10ml的离心管中，沉淀再用0.5ml溶菌 酶液和0.5ml 0.5% SDS洗涤一次，6000rpm离心5min，提取上清液（0.5ml 0.5% SDS=25ul 10% SDS+475ul 纯水）5. 然后往离心管中加入等体积（约2.5ml） tris-饱和酚抽提一次，12000rpm离心10min,提上清液6. 加入等体积tris-饱和酚：氯仿：异戊醇Q5:24:1）抽提一次，12000rpm离心 10min,提上清液7. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提两次
7、，12000rpm离心10min，提上清 液8. 将上清液分装于2-3管2ml离心管中，分别加入0.25倍体积的3M乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，于-20C过夜沉淀9. 然后在室温下12000rpm离心10min，去上液10. 沉淀用1ml 70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心10min，去上液11. 无水乙醇洗涤一次，12000rpm离心10min，去上液，倒置于吸水纸上，在超 净工作台下吹十5min12. 重悬于50ul TE中，样品在-20C冰箱中保存。13. DNA的检测：5ulDNA样品+1ul loading buffer，1%琼脂糖凝胶电泳 120V,40min，最左边点Marker （样品DNA长度约为20kb），电泳结束后照胶仪 下观察。
