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1、酶切位点保护碱基-PCR 引物设计用于限制性内切酶酶切反应本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如 AccI ，AflIII ，AscI ，AvaI ，BamHI ，BglII ，BssHII ，BstEII ，BstXI ，ClaI ， EcoRI ，HaeIII ，HindIII ，KpnI ，MluI ，NcoI ，NdeI ， NheI ，NotI ，NsiI ，PacI ，PmeI ，PstI ，PvuI ，SacI ，S acII ，SalI ，ScaI ，SmaI ，SpeI ，SphI ，StuI ，XbaI ，XhoI ，XmaI ，为什么要添加保护碱基？在分子
2、克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计 PCR 引物时，人为的在酶切位点序列的 5端外侧添 加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时， 最关心的应该是保护碱基的数 目，而不是种类。什么样的酶切 位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引
3、物的 Tm 值和各引物的碱基分布及 GC 含量。如果某条引物 Tm 值偏小， GC% 较低，添加时多加 G 或 C ，反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求， NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 基， 以确保酶切反应的进行。6 个保护碱实验方法：用 - 32 PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A 单位的寡260核苷酸。取 1g 已标记了的寡核苷酸与 2
4、0 单位的内切酶，在 20C 条件下分别反应2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl , 52mMDTT 及适量的 NaCl 或 KCl （视酶的具体要求而定）。 20% 的 PAGE （7M 尿素） 凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则 可能因为出现发夹结构而降低。切割率%酶寡核苷酸序列Acc I GGTCGACCCGGTCGACCGCCGGTCGACCGGAfl III CACATGTGCCACATGTGGCCCACATGTGGG2 hr000090
5、9020 hr00009090Asc IGGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA909090909090Ava I CCCCGGGGCCCCCGGGGGTCCCCCGGGGGABamH I CGGATCCGCGGGATCCCGCGCGGATCCGCGBgl II CAGATCTGGAAGATCTTCGGAAGATCTTCCBssH II GGCGCGCCAGGCGCGCCTTTGGCGCGCCAA509090109090075250050909090259090090900090BstE IIBstX IGGGT(A/T)ACCCAACTGCAGAACCAATGCATTGG
6、AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0025251005090Cla I CATCGATGGATCGATCCCATCGATGGCCCATCGATGGG009050009050EcoR I GGAATTCCCGGAATTCCGCCGGAATTCCGGHae III GGGGCCCCAGCGGCCGCTTTGCGGCCGCAAHind III CAAGCTTGCCAAGCTTGGCCCAAGCTTGGGKpn I GGGTACCCGGGGTACCCCCGGGGTACCCCGMlu I GACGCGTCCGACGCGTCGNco I C
7、CCATGGGCATGCCATGGCATGNde I CCATATGGCCCATATGGGCGCCATATGGCGGGGTTTCATATGAAACCC90909090909000100909002505000009090909090900075090900500750000GGAATTCCATATGGAATTCCGGGAATTCCATATGGAATTCCCNhe I GGCTAGCCCGGCTAGCCGCTAGCTAGCTAGNot I TTGCGGCCGCAAATTTGCGGCCGCTTTAAAATATGCGGCCGCTATAAAATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATAAGGAAA
8、AAAGCGGCCGCAAAAGGAAAANsi I TGCATGCATGCACCAATGCATTGGTTCTGCAGTT75750101001010252510909090025500101090909090Pac IPme ITTAATTAAGTTAATTAACCCTTAATTAAGGGTTTAAACGGTTTAAACCGGGTTTAAACCCAGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG00000075025900255090Pst I GCTGCAGCTGCACTGCAGTGCAAACTGCAGAACCAATGCATTGGAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAACTGCAGA
9、ACCAATGCATTGGATGCATPvu I CCGATCGGATCGATCGATTCGCGATCGCGA0109090001000109090002510Sac ISac IISal ICGAGCTCGGCCGCGGCTCCCCGCGGGGAGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCGCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGG10050010101009005075AASca I GAGTACTCAAAAGTACTTTT10752575Sma ICCCGGGCCCCGGGGCCCCCGGGGG001
10、0101050TCCCCCGGGGGA 90 90Spe I GACTAGTCGGACTAGTCCCGGACTAGTCCGCTAGACTAGTCTAGSph I GGCATGCCCATGCATGCATGACATGCATGCATGTStu I AAGGCCTTGAAGGCCTTCAAAAGGCCTTTTXba I CTCTAGAGGCTCTAGAGCTGCTCTAGAGCACTAGTCTAGACTAGXho I CCTCGAGGCCCTCGAGGGCCGCTCGAGCGG10100000109090900907575010109090505002550909090090909002575Xma I CCCCGGGGCCCCCGGGGGCCCCCCGGGGGGTCCCCCCGGGGGGA02550900759090注释：1 如果要加在序列的 5端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的 5 端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在 3 端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列 （红色）的 3 端加上相应的碱基（黑色）。2 切割率：正确识别并酶切的效率3 。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。
