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1、Pierce Magnetic RNA-ProteinPull-Down Kit说明书20164thormo scientific（英语水平有限 不对之处敬请指正 by 朵朵）其他材料要求目标标记RNA加热混合器或冷水机组氯仿:异戊醇(24:1)无水乙醇, 细胞裂解液(用于制备细胞裂解产物)（IP级蛋白提取液）交替洗脱缓冲:SDS上样缓冲(可选)Tris-buffered含有0.05%tween-20洗涤剂(TBS-T)磁力架免疫印迹试剂硝酸纤维素膜(产品)或PVDF(产品号88585)山羊Anti-Mouse免疫球蛋白g(H + L),合共轭(产品号31430) 辣根标记的二抗羊抗鼠Supe
2、rSignal发光液(产品号34080)做WB发光用的超敏发光液电泳仪器 转膜仪器注意：在无RNA酶的条件下 操作，戴手套，口罩，清洁台面，使用无酶的反应器。A 磁珠的预处理1。轻柔地摇动使磁珠重悬。2。吸取一定量的磁珠至一个无酶EP管。3。放置于磁力架上将磁珠收集在一起。4。2 x体积的0.1 m氢氧化钠洗两次磁珠,50 mm氯化钠(nuclease-free)。5。生理盐水在100mM洗磁珠一次。6。继续用磁力架平衡磁珠捕获。B 细胞的裂解细胞裂可使用标准的细胞裂解液。(e.g., Thermo Scientific Pierce IP Lysis Buffer, M-PER Mammal
3、ian Protein Extraction Reagent and T-PER Tissue Protein Extraction Reagent).体外翻译的蛋白（可以用人类体外表达工具）(e.g., Thermo Scientific 1-Step Human IVT Kits, Product No. 88881-9)也可用来检测该蛋白质绑定RNA的的能力。确保细胞裂解后蛋白浓度大于2毫克/毫升,其中不能含有高盐或洗涤剂，否则会干扰绑定反应,C 标记目的RNA用20163标记目标RNA。注意：最后加入PEG30%并充分混合，放于合适的温度，合适的时间。为了pull-down反应，用等体
4、积的氯仿：异戊醇24:1,提取标记的RNA ，并使用无水乙醇沉淀RNA。D 绑定标记RNA链霉亲和素的磁珠注意：使用25-100pmol RNA 比20-50ul 的磁珠。如下说明用的是50pmolRNA 和 50ul 磁珠。注意：阳性和阴性RNA对照都在试剂盒中。用于检测用户提供的RNA的特异性，需要检测阳性、阴性和只含裂解液的对照1、加入50ul 磁珠到1.5mlEP管中。2、放置于磁力架并使其沉于底部。弃上清。3.用等体积的20mM Tris （PH7.5）,用移液器或者漩涡器重悬磁珠。4.重复步骤2-35.重复步骤26.加入等体积的1XRNA Capture Buffer. 用移液器或
5、者漩涡器 重悬磁珠。7.加入50pmol标记的RNA到磁珠，用移液器轻柔地混合8. 在室温下搅拌孵育15 - 30分钟E RNA-蛋白绑定注意：Protein-RNA绑定缓冲液是作为绑定反应的起点，额外的试剂也可以被添加到绑定缓冲液用以提高亲和力和特异性。User-developed binding buffers 也兼容这个试剂盒。1、置于磁力架，收集磁珠，弃上清。2、用等体积的20mM Tris （PH7.5）,用移液器或者漩涡器重悬磁珠。3.重复步骤1-24. 重复1.5.稀释10X蛋白-RNA绑定buffer至1X6.加入100ul1X的蛋白RNA绑定buffer 到磁珠中并混合均匀。
6、7.准备一个RNA-蛋白绑定体系8. 置于磁力架，收集磁珠，弃上清。9.加入100ul 步骤7制备的混合液到RNA绑定的磁珠中，混合均匀。10.孵育30-60分钟，4搅拌或者旋转。f .洗涤和洗脱的rna结合蛋白复合物1. 置于磁力架，收集磁珠，收集上清2.加入等体积的1Xwash buffer （100ul）3.重复两次步骤1和2，收集上清进行分析。4.重复1步骤。5.加入50ulElution Buffer 到磁珠并涡旋混合。37摄氏度 孵育15-30分钟。6.置于磁力架，收集磁珠7.收集上清进行分析8.如果下游需要继续做wb，加入上样BUFFER9.100摄氏度加热5-10分钟，跑胶或者冻-2010.每个泳道加入30ul。G Western Blot步骤省略注意：HUR条带在36kDa
