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1、硫酸葡聚糖对低离子强度下罗非鱼肌球蛋白热变性聚集的抑制及其机制李婷;周春霞;冯瑞;洪鹏志【摘 要】以罗非鱼背部白肉为原料提取肌球蛋白,分析在低离子强度(1,50,150 mmol/L KCI)下，硫酸葡聚糖(dextran sulfate,DS)的添加对热处理(40 80乜1工伽)过程中肌球蛋白(2.0 mg/mL)溶解度和分子结构的影响，探讨DS对 肌球蛋白热变性聚集的抑制效果及机理结果表明，在1 mmol/L KCl条件下，肌球蛋 白溶解度极低，热处理后分子头部聚集，尾部交联;在50,150 mmol/L KCl条件下，肌 球蛋白纤丝逐渐解离变粗,热处理后丝状体消失，头部聚集，溶解度、a螺
2、旋含量明显 下降添加0.4 mg/mL DS后，热处理过程中体系浊度、溶解度和a-螺旋含量无明 显变化，与未添加DS的体系相比，相同温度条件下肌球蛋白的溶解度明显增大(P v 0.05),表面电势升高.DS与肌球蛋白分子间强的静电相互作用能有效抑制低离子强 度下肌球蛋白的热变性聚集.【期刊名称】食品与机械【年(卷),期】2018(034)012【总页数】6页(P5-10)【关键词】 肌球蛋白;低离子强度;热变性聚集;硫酸葡聚糖;抑制机理【作 者】 李婷;周春霞;冯瑞;洪鹏志【作者单位】 广东海洋大学食品科技学院,广东湛江524088;广东省水产品加工与 安全重点实验室,广东湛江524088;广
3、东海洋大学食品科技学院,广东湛江524088; 广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学食品科技学 院,广东湛江524088;广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江524088;广东 海洋大学食品科技学院,广东湛江524088;广东省水产品加工与安全重点实验室,广 东湛江524088【正文语种】中 文 肌球蛋白是鱼类肌肉蛋白的主要成分，该蛋白以2个球状头部和1个棒状尾部为 骨架构成了约160 nm的长型不对称结构1。肌球蛋白为盐溶性蛋白，在高盐溶 液(600 mmol/L KCI)中，肌球蛋白以单体或可溶性寡聚体2形式分散在溶液中， 体系热稳定性较好，这在食品的
4、保水性和质地方面起着非常重要的作用。而在低盐 溶液(v200 mmol/L KCl)中，肌球蛋白不易溶解2，受热易发生变性聚集并伴有 弱凝胶形成的趋势，不利于水产品的精深加工。热稳定性是蛋白质重要的功能特性， 通过添加化学助剂来改善蛋白质热稳定性的研究繁多。一些多糖如果胶、卡拉胶能 够吸附在球状蛋白质表面形成一层“保护膜”，通过搭建静电屏障来提高蛋白的热 稳定性3；生物类表面活性剂鼠李糖脂4和海藻糖脂5可以提高蛋白质的热解折 叠温度，并且随添加量的增加，蛋白质热解折叠温度进一步提高，但研究对象均以 牛血清白蛋白(BSA)为模型。Takai等6证明精氨酸可以显著提高猪肉肌球蛋白在 生理盐溶液中的
5、溶解度而不影响其二级结构；Gao等7向0.1 moI/L NaCI中添 加5 mmol/L组氨酸后，鲤鱼肌球蛋白溶解度明显增加，形态学结果观察到在热 处理过程中组氨酸诱导肌球蛋白形成了更细的聚集体和蜂窝状网络；但时娇娇 851-52、石彤9的研究显示精氨酸、组氨酸对低离子强度下鱼肉肌球蛋白的热 聚集无明显抑制效果。相较于植物蛋白而言，水产蛋白热稳定性较差，而一些改善剂如果胶、卡拉胶等大 分子多糖通常需要特定的pH和较高的温度条件才能溶解，在改善鱼肉蛋白热稳定 性时受到了限制。硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)在室温及中性条件即可溶解， 更适合应用于食品体系。研究10-11证实D
6、S可有效抑制蛋白质的热聚集，但鲜 见在鱼肉蛋白中的应用。为此，本研究以肌球蛋白为模型，在低离子强度 (1，50， 150 mmol/L KCI)热处理(40,50,60,70,80 C,1 C/min)条件下，探讨 DS 对肌球蛋白热变性聚集的抑制效果及作用机理，提高对带电多糖蛋白质相互作 用的认识,为肌球蛋白的基础研究提供理论参考。1 材料与方法1.1 材料与主要试剂鲜活罗非鱼：湛江市场(2018年36月)；硫酸葡聚糖(dextran sulfate , DS)、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-AniIino-1- naphthalenesulfonic acid , ANS):分析纯，美国 S
7、igma 公司； Lowry蛋白浓度测定试剂盒：上海荔达生物科技有限公司。1.2 仪器与设备高速冷冻离心机：Avanti J-26sxp型，美国贝克曼公司；恒温水浴锅：TU-20HT型，英国比比科技有限公司；圆二色谱仪：Chirascan V100型，英国应用光物理公司；纳米粒度分析仪：Nano-2s MPT-2型，英国马尔文仪器有限公司。1.3 试验方法1.3.1 肌球蛋白的提取根据洪伟12的方法,所用溶液均提前预冷至4 C。1.3.2 样液的制备用 Tris-HCl 缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl ,1,50,150 mmol/L KCl , pH 7.0)对肌球蛋白透析24
8、 h。Lowry法13测定蛋白浓度，用对 应的Tris-HCl缓冲液稀释至2.0 mg/mL。将肌球蛋白溶液分为两组：未添加组；添加组：向不同离子强度(1, 50 ,150 mmol/L KCI)下肌球蛋白溶液中加入0.4 mg/mL的硫酸葡聚糖。1.3.3程序升温处理运行程序控温热处理软件，设置升温速率为1 C/min。用温 度计测量样液温度为40,50,60,70, 80 C时14取出备用。对照组温度为4 C。1.3.4浊度的测定稀释蛋白浓度至0.5 mg/mL，在350 nm处测吸光度14。1.3.5 溶解度的测定参照文献13。溶解度按式(1)计算：(1)式中：c溶解度,%；m1上清液中
9、可溶性蛋白浓度，mg/mL ;m2离心前蛋白浓度，mg/mL。1.3.6二级结构a-螺旋含量分析蛋白浓度稀释为0.1 mg/mL，设置扫描范围为 190-260 nm。样品池光径为1 mm，对照组测量温度为4 C。使用仪器控温程 序进行热处理，升温速率为1 C/min,在40,50,60,70,80 C时测试。根据 Ogawa等15的方法计算a-螺旋含量。1.3.7表面电势的测定固定蛋白浓度1 mg/mL，设置He-Ne激光为633 nm、散 射角为9016对样品进行除尘。使用Smoluchowski方程计算电势值。1.3.8透射电镜分析固定蛋白浓度0.25 mg/mL滴于150目铜网，超纯水
10、多次冲 洗后用0.5% 1.0%的醋酸双氧铀负染17并放入烘干箱(37 C)烘干。1.4 数据处理使用Origin 9.0软件对文中各数据作图，用SPSS 19.0比较分析差异显著性 (P0.05)。2 结果与分析2.1 硫酸葡聚糖对肌球蛋白浊度的影响固定肌球蛋白2.0 mg/mL，加入0.4 mg/mL硫酸葡聚糖(DS)后，用对应离子强 度的Tris-HCI缓冲液稀释至0.5 mg/mL，肌球蛋白体系浊度的变化如图1所示， 在低离子强度(1 mmol/L KCl)下，肌球蛋白呈不溶状态2，蛋白溶液浑浊，可检 测的浊度值高，热处理后肌球蛋白分子进一步聚集，体系浊度明显增大 (P0.05)，当温
11、度为40 C时，肌球蛋白溶解度下降到约8% ;添加DS后，肌球蛋白溶解度降低(Pv0.05)，表明未经热处理时DS对低离子强度 下肌球蛋白无增溶效果，可能是肌球蛋白和DS均属于大分子产生了相分离现象 19 , DS此时无法与肌球蛋白完全结合。但在热处理过程中含有DS的肌球蛋白 溶解度变化不明显，当温度达到50 C时，其溶解度仍高于30%，表明DS能明显 抑制低离子强度下肌球蛋白的热聚集。随着离子强度的升高，肌球蛋白溶解度随之升高，这是因为盐离子可诱导肌球蛋白 纤丝解聚，分子以单体或可溶性寡聚体形式存在20。因此，在生理离子强度(150 mmol/L KCl)下可达84%。添加DS后，50 mm
12、ol/L KCl溶液中肌球 不同大与字母表示同一温度之间差异显者(PvO.O5)；不同小与字母表示同一样品 之间差异显著(PvO.O5)图1硫酸葡聚糖对肌球蛋白浊度的影响Figure 1 Effect of DS on the turbidity of myosin蛋白溶解度降低(PvO.05)，生理离子强度(150 mmol/L KCI)下无明显变化 (P0.05)。但与未添加DS的肌球蛋白体系比较，添加DS后进一步热处理过程中 肌球蛋白溶解度增加(Pv0.05)，表明DS能部分抑制肌球蛋白的热聚集。2.3 硫酸葡聚糖对肌球蛋白电势的影响为了进一步探讨DS对肌球蛋白热聚集的抑制机理，对3种离
13、子强度下肌球蛋白分 子的表面电势进行分析，结果见图3。在试验范围内(pH 7.0)，肌球蛋白整体带负 电，随着KCI浓度的升高，体系电势逐渐减小，可能是盐离子的增加对肌球蛋白 分子表面扩散双电层产生了压缩作用21，使肌球蛋白溶解度增加。经过热处理后， 在1, 50 mmol/L KCI条件下，随着热处理温度的进行(40 70。0,肌球蛋白体 系电势逐渐减小，质点间相互排斥作用减小，分散体系被破坏，分子间吸引力大于 排斥力，发生聚集22。具体表现为悬浮液浑浊、颗粒粒径增大，溶液中可溶性蛋 白含量明显下降。在150 mmol/L KCI下，盐离子改变了带电颗粒周围的离子分 布23，随温度升高表面电
14、势有升高的趋势。添加负电性多糖DS后，试验范围内 肌球蛋白体系电势均明显增加(Pv0.05)，在1 mmol/L KCI条件下最为明显，与对 照组相比体系电势增加了约25 mV,表明DS与肌球蛋白分子形成了稳定的分散 体24。与未添加DS的肌球蛋白体系比较，在1, 50 mmol/L KCI条件下，热处 理初期肌球蛋白分子受热部分展开，肌球蛋白表面带正电荷的一NH3+通过静电相 互作用与DS上带负电的一OSO3-结合形成复合物25，这种吸引作用比一NH3 + 与一CO2-的吸引作用要强烈，使得同温度下肌球蛋白电势明显增大(Pv0.05)，分 子间排斥力大于吸引力，蛋白溶解度增加；当温度升高到60-80 C时，肌球蛋白 表面电势依然较高，溶解度无明显变化，说明DS-肌球蛋白形成的复合物热稳定 性较好。而在生理离子强度下，在50-80 C温度区间内，DS对肌球蛋白电势无 明显影响，可能与盐离子的干扰作用抑制了 DS的作用效果有关。因此，低离子强 度下DS抑制肌球蛋白热聚集的效果可能与分子间强的静电相互作用有关。不同大写字母表示同一温度之间差异显者(PvO.O5)；不同小写字母表示同一样品 之间差异显著(PvO.O5)图2硫酸葡聚糖对肌球蛋白溶解度的影响F
