哮喘小鼠动物模型的建立与评价

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1、哮喘小鼠动物模型的建立与评价郑凌霄;于芬芳;刘曼曼;尹灿灿;张莺莺;孙恩涛【摘 要】哮喘是一种慢性炎症性疾病.借助哮喘动物模型不仅可用于哮喘疾病发生 原因和发病机制研究,也可用于相关药物的药效研究.人类和动物之间存在物种差异, 因此,全面、成功地建立一个与临床发病机制相似的、稳定可靠的哮喘动物模型非 常重要.本文就哮喘模型的品系选择、模型建立及评价指标作简要分析.期刊名称】热带病与寄生虫学年(卷),期】2017(015)004【总页数】4页(P244-247) 【关键词】 哮喘;小鼠模型;模型建立;评价指标【作 者】 郑凌霄;于芬芳;刘曼曼;尹灿灿;张莺莺;孙恩涛【作者单位】 241002 安

2、徽芜湖市,皖南医学院公共卫生学院;241002 安徽芜湖市, 皖南医学院公共卫生学院;241002 安徽芜湖市,皖南医学院公共卫生学院;241002 安徽芜湖市,皖南医学院公共卫生学院;皖南医学院弋矶山医院;241002 安徽芜湖市, 皖南医学院公共卫生学院【正文语种】 中 文支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，给患者及其家庭和社会带来沉重的负担 全球约有3 亿哮喘患者，我国哮喘发病率呈上升趋势，已成为全球哮喘病死率最 高的国家之一。因此，对哮喘的发生原因和发病机制的深入研究具有重要的价值。 由于人体研究的局限性和伦理学上的要求，需通过哮喘动物模型的建立提供有关哮 喘发病机制和治疗上的有价值

3、的信息。在众多模拟人类支气管哮喘的动物模型中， 虽兔、猫、犬、羊及灵长类动物也可用于复制哮喘模型，但都不是理想的选择对象， 目前鼠类哮喘模型应用最多1。一、动物选择1. 豚鼠豚鼠易被致敏，是最早选用的哮喘动物模型。接触致敏原后反应程度强，产生I型 变态反应，故常用于研究抗过敏、支气管哮喘药物方面的研究，也用于职业性哮喘 模型的制作。但是在用卵清蛋白复制豚鼠动物模型时，因其个体反应差异大，对致 敏原或无反应或产生过敏性休克死亡。通常在激发前需注射抗组胺药物，不仅费用 高，而且缺乏相关免疫学和分子生物学试剂2。此外，豚鼠哮喘变态反应机制多 由IgG所介导，而非IgE。因此，现在多选用大鼠和小鼠制作

4、哮喘模型。2. 大鼠 大鼠具有价廉易养、繁殖快、生物学试剂易得等优点，易于制作哮喘模型，且大鼠 过敏反应多由IgE介导，与人类哮喘反应特点相似。国外多用BN大鼠复制哮喘模 型，在特异性抗体的产生及诱发哮喘症状上优势明显。但是价格昂贵、较难获得， 国内多用SD大鼠和Wistar大鼠。SD大鼠较Wistar大鼠对呼吸道疾病的抵抗力 更强3。但大鼠制备哮喘模型在试验中更注重于观察气道高反应性(Airway hyper reactivity, AHR)，模型重复稳定性欠佳4。3. 小鼠 小鼠免疫遗传背景清楚、品系纯、成本低、来源广，随着生物测定技术的迅速发展 和大量相关生物学试剂及抗体可供使用，小鼠在

5、国内外已成为主要的哮喘动物模型。 本研究对小鼠模型进行综述。二、品系选择根据遗传特性的不同，实验小鼠品系可分为近交系、突变系、远交群和杂交群。其中有200多个近交系可供选择，常用的小鼠品系有BALB/c、C57BL/6、A/J等。 本文以哮喘和小鼠为主题词检索近10年PubMed数据库中的文章，共发现6262 篇文献，其中使用 BALB/c 和 C57BL/6 制作哮喘小鼠模型比例分别占 37.86% 和4.25%，BALB/c使用频率约为C57BL/6的8.9倍，A/J模型制作比例为0.45%。不同品系小鼠对致敏原敏感性不同，且抗原激发后其炎症表现也不同。本 文通过对最常用的前两种小鼠品系进

6、行分析，为制备出接近人类慢性哮喘特征的小 鼠模型提供基础。1. BALB/C 小鼠起源于小家鼠Mus musculus，广泛用于免疫学、生理学的动物实验，也用于支 气管哮喘的动物实验模型。在哮喘的小鼠模型中BALB/c小鼠使用最多，雌性小鼠 比雄性小鼠过敏性气道炎症的效果更显著2。因此常选用68周、18-22 g雌 性小鼠。邓学泉等5将24只BALB/c小鼠分为A-D组，A、B两组分别以PBS、 卵清蛋白在第1 d致敏，第8-11 d雾化；C、D两组分别以PBS、卵清蛋白在第1、7、14 d致敏，第22-25 d雾化。研究发现BALB/c小鼠易产生针对卵白蛋 白和花粉的高滴度lgE和气道高反应

7、性。2. C57BL/6 小鼠起源于Abby Lathrop的小鼠株，实验多选用4-8周，体重18-22 g之间的小 鼠。国内黄华琼6用不同鼠龄的C57BL/6小鼠研究发现早期致敏有利于哮喘模型 的建立，早致敏晚激发可获得稳定的EOS炎症、黏液高分泌和气道高反应性的变 化。C57BL/6小鼠也可用卵清蛋白致敏、激发建立哮喘模型，但C57BL/6小鼠在 气道反应性上的变化不如BALB/c小鼠。所以在哮喘模型的应用上较少。C57BL/6 小鼠对尘螨和豚草抗原反应性较强，因此在有机粉尘诱发的哮喘模型中选用较多。三、模型建立对于不同种类的哮喘模型，建模方法也有多种选择。不同的致敏方法会影响小鼠哮 喘模

8、型的建立，包括致敏时间、致敏原的剂量和浓度、致敏的次数。过敏性哮喘小 鼠的致敏周期一般为两周，根据不同试验选择不同的致敏时间。下面以哮喘的不同 类型，分别阐述各类哮喘模型的建立进展。1.变态反应哮喘(1)卵清蛋白(ovalbumin, OVA )诱发的支气管哮喘模型卵清蛋白是目前使用最广泛的致敏原，具有价格便宜、获得方便、抗原性强等优势， 常与非免疫原性佐剂联合使用。BALB/c小鼠对OVA致敏易产生气道高反应性和 高滴度lgE超敏反应，更适合Th2型反应7。乐晶晶等8选用BALB/c小鼠在第 1天腹腔注射含OVA100 pg与氢氧化铝凝胶混合液300 pl;第8 d、15 d加强 致敏2次。

9、第22 d、28 d给予含2.5%OVA的生理盐水溶液20 pl滴鼻激发，通 过间隔致敏3次，激发2次，激发后立即取材。发现模型组小鼠IFN-y的水平明 显降低，IL-4水平升高，Th1/Th2比例失衡，Th2优势表达。Zhang等9在第1、 7、14 d腹腔注射卵清蛋白50 pg和2 mg氢氧化铝乳化；在第21天肌肉注射 100 pl亚单位流感疫苗；第28日增加40 pl疫苗滴鼻；随后，在哮喘对照组小鼠 和流感病毒亚单位疫苗暴露于OVA悬浮物中连续3d(第42、43、44 d)。验证了 在哮喘小鼠模型中，使用流感病毒亚单位疫苗不加剧哮喘症状，且相对安全。Newcomb等10在IL-17A基因

10、敲除小鼠，经OVA致敏激发过程中表现出更强 烈的气道高反应性和气道炎症症状。在过敏性哮喘的治疗方面也多用卵清蛋白诱导建模，吸入糖皮质激素是目前最有效 的治疗哮喘方法，但是对气道重塑的作用很有限，Kang等11通过建立小鼠气道 重塑模型研究表明在慢性哮喘模型中尼洛替尼和氟替卡松分别通过抗炎和抗纤维化 的途径抑制气道重塑。Lebold12、Nadeem等13用卵清蛋白诱导过敏性小鼠 模型研究 Toll 样受体 7 在过敏性气道疾病的治疗，发现 TLR-77 激动剂是有益的，。W腿二、ffiMgEm 娜如、mEWHSO7已枷 uoss d OFOlnEllelAI osstos Tmwp m 胆*、

11、imili ffis M ,EwsldffiI、囂P300 旺遇00已枷愉聊塢 OHiwfflrsssisi 0 旺 ffll o Jolies 旺ttm、sffissisi osrol iwfflrsnsl、廿硼5-._stsru匸一吕补uAs A01e_dsEw如&吿眠呂恥槨旺遇 。卑旺壯屁血、旺 刼8 ss oim if 。汉 Mssi、Elwsfflssfiswos sssrsn oilsslollf SI zfflss-Rr販 HJMft、SSHBifflwJ 旺屁CNCN爲 OQ。0 凶wBMas z2es OSSI fflsHh旺归羽长览BM、$ osissAi、i siw 必旺

12、 ,ffi汕旺遇Hss映底枷odseolp 乏。勵日Is 启些骰呃恤坐他0槪祐&v吕血启、S1SS旺归垣曲0皿悭岳坐契汕等。生命早期吸入性变应原致敏和哮喘性疾病与病毒和细菌感染有关，特别是婴幼 儿时期的呼吸道合胞病毒感染已被确定为哮喘起始关键风险因素24。越来越多的 研究者用呼吸道合胞病毒诱发小鼠，目的是为了复制出更符合人类慢性病哮喘发作 反应的小鼠支气管哮喘模型。蒋雄斌等25利用呼吸道合胞病毒诱导致敏小鼠建立 重度哮喘模型，与用 OVA 诱导的致敏激发比较，发现 RSV 感染小鼠哮喘发作十 分频繁，气道反应性也进一步增高。Rakesh等26也发现感染呼吸道合胞病毒被 成功用于短期增强模型，可

13、以增强炎症细胞因子水平，增加或延长 AHR。3. 职业性哮喘 这种类型的哮喘主要环境诱发因素包括环境化合物、工作环境、过敏原的暴露等。 职业性哮喘的动物模型多以小分子半抗原致敏，常选用苯酐类低分子化合物，制作 模型时需结合载体蛋白形成抗原，且多以豚鼠和大鼠构建模型。Jude等27发现 甲醛加重哮喘的协同作用与过敏原诱导的气道高反应性，可以类似佐剂的作用加重 小鼠哮喘模型。四、哮喘动物模型的一般评价指标 研究目的不同，研究用的动物种类、品系和评价指标也不同。以下为常见的动物模 型的评价指标，适用于鼠类模型的评价。1. 发作的临床表现 典型的哮喘发作症状表现为呼吸加快、竖毛、口唇发绀、前肢缩抬、四

14、肢瘫软、反 应迟钝、点头呼吸等；严重时会出现腹肌抽搐和二便失禁，并随着激发次数增加症 状逐步加重。不同动物出现的症状略有不同，进行试验时还要考虑动物种类及品系 的选择。2. 肺组织病理 组织形态学指标也是评价哮喘模型是否成功的重要指标。哮喘由于急性炎症反复发 作而转变为慢性炎症，气道反复损伤与修复，大量炎性细胞、炎症介质浸润并继发 气道重塑。模型小鼠肺组织大体观察：肉眼可见小鼠肺脏呈均匀性膨大，色发白、 多处不规则的暗红色冲血区，切面有白色粘稠的分泌物渗出。苏木精-伊红染色可 观察到：肺内支气管及血管周围大量炎性细胞浸润，炎性细胞和渗出物增多，粘液 栓形成28。3. 嗜酸性粒细胞检测 嗜酸性粒

15、细胞是参与哮喘发病的关键细胞之一，造模时既要出现典型的哮喘发作症 状，又要肺组织嗜酸性粒细胞的大量侵润且肺泡灌洗液、血液中要有嗜酸性粒细胞 数量变化。不同的哮喘模型中细胞成分不同，根据刘中成等29的统计，慢性哮喘 模型肺组织中嗜酸性粒细胞及巨噬细胞所占比例低于急性哮喘模型(PvO.O5 ,PvO.01)，淋巴细胞所占比例在两者之间没有统计学差异。4. 免疫学指标哮喘属于一种免疫变态反应性疾病，多数学者认为是Th1功能低下、Th2功能相 对亢进导致的，同时也有IL-4、IL-5、IL-10、IL-12、IL-13及粒细胞巨噬细胞-集 落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-y(IFN-y)、单核细胞趋化因子-1和-3(MCP-1和 MCP-3)和血管内皮细胞粘附因子-1等细胞因子的参与。5. 肺功能变化 肺功能检测是诊断哮喘和评估哮喘控制程度的重要检查方法。刘中成29等实验结 果显示哮喘模型组动物呼吸明显加深、加快，呼吸速率及呼气流