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1、1.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因并提出解决的方案? （6分）答：(1)导致星号活性因素：a较高的甘油浓度 b酶与底物DNA比例过高（不同酶情况不同，通常为100v/micHo.g） c 低盐浓度（PH8.0） e 存在有机溶剂（如DMSO .乙醇（9）.乙烯乙二醇.二甲基乙酰胺.二甲基甲酰胺.sulphalane(12)等） f用其他二价离子代替Mg2+(Mn2+.Cu2+.Co2+.Zn2+等) （2）抑制星号活性的方法：a尽量用较少酶进行完全消化反应，这样可避免过度消化及过度的甘油浓度. B尽量避免有机溶剂（如制备DNA时二乙醇）污染 c 将离
2、子浓度提高到100150mM（若酶活性不受离子浓度影响） d将反应缓冲液PH值降到7.0 e 二价离子用Mg2+3、目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？（10分）答：a.目的基因的表达方式，细胞内表达或者分泌细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长C.目的基因的抗体特异性不好则很难以检测表达D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将你的产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有。E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达.4蓝白斑筛选法为什么也会有假
3、阳性?答：蓝白斑筛选法出现假阳性的原因：-半乳糖苷酶的N末端是非必须的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或肽的互补性。如果插入的外源DNA引起肽的可读框的改变或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA中不含有终止子的话，仍会形成蓝白菌落。这种插入物的长度可达几百个碱基对（1）蓝白斑筛选法原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖甘酶基因片段，在半乳糖甘酶基因区外又另外引入了一段含有多种单一限制性酶切位点的dna序列，这些位点上如果没有克隆外源性dna片段，在质粒导入Lac的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌
4、的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入底物Xgal和诱导剂IPTG后出来蓝色菌落；如果在多克隆位点上插入外源基因，则使LacZ基因灭火，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。(2)假阳性的原因：不一定就是目的基因5、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么? （8分）答：1.同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步，因为在非最佳缓冲条件下时的切割速率会减缓2 .分步酶切：应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切3
5、.使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切：在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切，这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减慢，因此需要增加酶量或延长反应时间6、用哪些方法可以检测转基因植物中的外源基因，如何检测？（8分）答：1、外源基因整合到植物基因组的检测SOUTHERN杂交、多聚酶链式反应、报告基因检测等2、外源基因在植物基因组中转录检测NORTHERN杂交是DNA-RNA杂交，它是检测特定组织或器官中外源基因是否转录出MRNA一种有用的方法3、外源基因在植物基因组中翻译的检测WESTERRN杂交则是蛋白质间的杂
6、交，它是检测特定组织或器官中外源基因是否有翻译出特定蛋白质的方法4、筛选标记基因，如抗菌素抗性基因，抗除草剂基因等来进行，当受体细胞本身不含此类基因时，导入含有或构建有此类基因的供体后，只要起在受体中转化成功，便可用抗菌素或除草剂等进行筛选。5利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定；7、请你自己设计一个抗除草剂X的转基因植物，并写出主要操作步骤。（10分）答：1.目的基因的获得：找到抗除草剂x基因用限制性内切酶进行酶切，在进行pcr2.转化：可以采用介导转化法，基因枪介导转化法，花粉管通道法3.筛选并检测：利用含有重组基因的植株的抗性进行筛选。已知某蛋白基因CDNA长度为1.8kb,两端的核
7、酸序列如下：ATGAGTGCCAATAGCCCGACAGGAAACGATCCCCATGTATTTGGTATTCAA-GAGCGCAAGTAGCACGCCCTCTTCTACTACAATGTCATAA3经分析发现该基因内部有如下限制性内切酶位点：AflII CTTAAG， EcoRV GATATC，XmaI CCCGGG，EcoRI GAATTC，SmaI CCCGGG， SacI GAGCTC， SalI GTCGAC， HindII AAGCTT， NotI GCGGCCGC。MCS：BamHI： G|GATCC； SmaI： CCC|GGG； SacI： G|AGCTC； SalI：G|TC
8、GAC； SphI： G|CATGC； XbaI ：T|CTAGA ；PstI：C|TGCAG； HindIII： A|AGCTT； KpnI：G|GTACC。现要把该基因克隆至表达载体pQE-30中，并转化到大肠杆菌中表达并规模化生产。1）写出可用的酶切位点；2）设计出PCR引物；3）设计PCR扩增的程序；4）详述克隆、筛选、表达纯化及其规模化的过程。（1）答：BamHI PstI XbaI KpnI SphI HindIII （2）答： PCR引物： 设计PCR 引物 上游引物：53 GGG / GGATCC(BamHI)/ATGAGTGCCAATAGCCGACAG Tm =4（G+C）+
9、2(A+T) =68下游引物: 53 GGG/CTGCAG(PstI)/TTATGACATTGTAGTAGAAGAG Tm=4(G+C)+2(A+T) =58（3）答：PCR扩增程序： 1 预变性：双链DNA在94度 左右预变性5min 2变性：94度下双链DNA变性30s 3退火：55度退火30s 4延伸：72度延伸 90s 5最后72度 延伸10min 循环三十次（4）答：克隆：将载体用BamHI酶和Xbal酶进行双酶切，然后将目的基因在体外用DNA连接酶与载体连接，导入事先做好的感受态细胞中，培养在含有氨苄青霉素的培养基上 筛选：以为载体上带有抗氨苄青霉素标记基因，所以能在培养基上存活的
10、即为转化子 表达纯化：将筛选出来的菌株进行培养，得到的产物进行分离纯化，因为载体上含有6个组氨酸基因，所以可以用亲合层析的方法进行提纯 规模化：将得到的单一菌株大规模培养，可以采用连续培养的方法进行，可以得到大量产物1、限制性内切酶分为几类？基因工程中常用的为哪一类？有何特点？（6分）答：1分三类：为限制性内切酶I型.II型.III型.2基因工程中常用的为II型。特点：识别双链DNA分子中48对碱基德特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。2、什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别? 答：（1）cD
11、NA文库是通过对一系列mRNA反转录并对特殊的克隆予以筛选得到的，cdna文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶作用下首先合成一条互补的DNA即第一链，破坏RNA模板后，在以第一链为模板合成第二链，得到双链的DNA即cDNA，选用适合的载体，将合成的cDNA重组导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群为cDNA文库（2）差别：基因组文库含有全部基因，cDNA文库含有全部蛋白编码的结构基因，cDNA文库小于基因组文库3、PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息? 答：（1）原理：DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性，复性和延伸。首先
12、是在dsDNA在高温下变性为ssDNA，然后DNA聚合酶以ssDNA为模板，利用聚合酶和dNTPs合成新生的DNA互补链，新合成的dsDNA经过变性，复性，延伸，如此反复循环，使目标DNA以指数形式扩增 （2）要已知待扩增目的基因或者DNA片段两侧的序列，据该序列化学合成聚合反应必须的双引物。或者至少预先知道，足够合成一对引物的靶DNA序列。4、目的基因与启动子拼接后，重组分子若不表达，应如何分析？（10分）答：a.目的基因的表达方式，细胞内表达或者分泌细胞外，如果蛋白为分泌性，那么细胞内检测不到表达，或者表达很少B.分子量大小，分子量大小决定了蛋白半衰期，因而检测需要延长C.目的基因的抗体特
13、异性不好则很难以检测表达D.许多表达宿主自身有自己的蛋白酶，会将你的产物降解，也可能因为修饰系统不同，使得产物的活性不高或者没有。E.如果宿主菌与蛋白来源菌不同也有可能由于密码子使用偏好性不同导致不表达.5、为什么pUC系列的载体与外源基因形成的重组体可以用蓝白斑实验进行筛选？答：pUC系列载体带有大肠杆菌的LacZ基因片段，在该基因内部含有多种限制性内切酶位点，在这些位点上如果没有克隆外源DNA片段，在质粒导入Lac的大肠杆菌后质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入底物Xgal和诱导剂IPTG后出来蓝色菌落；如果在多克隆位点上插入外源
14、基因，则使LacZ基因灭火，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色，由于这种颜色标志，重组与非重组体的区分一目了然。6、如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因? 答：先从表达该蛋白质的细胞中提取总的mRNA，根据蛋白质的氨基酸序列推测其dna序列，该序列制成探针，然后与提取出的mRNA杂交，能够杂交的即可选出，利用反转录的方法合成cDNA，再用pcr技术克隆该基因。7、欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如Ecoli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题? （10分）答：真核生物的结构基因含有内含子，转移的的目的基因要去除内含子，原核生物与真核生
15、物有密码子偏爱性。1、某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?（6分）答：1含Tet抗性的抗生素2.Tet(r)+Kan(r)+Tet(r) Tet(r)Kan(s)和Tet(r)Kan(r)3先将转化液涂皿在Tet平板，再将Tet平板上转化子影印在含Tet,Kan的平板上在Tet平板上生长，但在Tet,Kan平板上不生长的转化子即为含有插入片段的重组体2、简述差异杂交的原理及基本思路？答：原理：差异杂交是将基因组文库的重组噬菌体dna转移至硝酸纤维素摸上，用两种混合的不同cdna探针分别于滤膜上的dna杂交，分析两张滤膜上对应位
