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1、氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定张明铉 PB15030833开课实验室：环境资源楼 312【实验目的】1、掌握紫外分光光度法的分析原理与基本操作，熟悉紫外分光光度计的结构及特点，掌握其使用方法。2、学习紫外可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。3、了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。【基本原理】口原理概述：紫外光谱等物质的吸收光谱可以反映物质在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物 质因分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光 谱带有分子结构与组成的信息。口紫外分光光度法： 类型：吸收光谱法。原理：电子的跃迁：电子由于受到光、热、电等的激
2、发，从一个能级转移到另一个能级的现象。这是因为 分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。当这 些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。作图原理：物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪 录该物质在每一波长处的吸光度4然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的 谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线；定量关系：当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度 I0 与透过光强度 It 之比的对数与该物质的 浓度 c 及厚度 b 成正比。其数学表达式，即 Lambert-Be
3、er 定律，为：=kbc这是是分光光度法定量分析的基础， T 为透光率（比）。仪器构造：图 1 紫外分光光度计仪器简图数据处理和仪器控制口氨基酸：定义：含有氨基和羧基的有机物，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位。光学性质：对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区( 10000maxL mol-1 cm-1,三种氨基酸均有n n *跃迁，而酪氨酸还有nn *跃迁（不过这种跃迁的吸收强度小）, 所以最大吸收峰处的吸收强度苯丙氨酸较小，但总体差别不大。2. 绘制色氨酸和赖氨酸溶液的一至四阶吸收光谱：要求当干扰物质酪氨酸的纵坐标数值绝对值小于 0.001。可以看到当酪氨酸导数为
4、零时色氨酸较大的导数值与对应波长为：（221.96 ， - 0.838）可以看到当酪氨酸导数为零时色氨酸较大的导数值与对应波长为：（230.80 ，0.163）可以看到当酪氨酸导数为零时色氨酸较大的导数值与对应波长为：（224.74，0.069）3. 工作曲线绘制最后选定用一阶导数来作工作曲线。将配制的各标准色氨酸溶液的光谱在221.96nm处的值为纵坐标，相应的 浓度为横坐标绘制工作曲线，再根据未知溶液的吸光度，利用标准曲线求出待测样浓度。(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准溶液(b) 100mg/L的色氨酸溶液稀释至10 mL,对应浓度分别为2、4、6、8、10 mg/L)-
5、0.1 -0.2 -0.3 -值-0.4 - 数 一 导阶-0.5 - -0.6 -0.7 -0.8 -工作曲线Linear Fit of Sheetl B阶导数值Equationy = a + b*xIntercept-0.0139 ?0.02461Slope-0.08015 ?0.00371Residual Sum of Squares0.00165Pearsons r-0.9968R-Square(COD)0.99361Adj. R-Square0.99148246810浓度 (mg/L)图 12 工作曲线得到工作曲线如图11,得到吸收值一次导数与溶液浓度的关系I = -0.08015
6、c - 0.0139,相关系数R2=0.99361, 线性拟合较好。未知溶液的紫外吸收光谱一阶导数在221.96nm处的值为-0.425,带入工作曲线方程得到未知溶液中色氨酸 浓度为：5.129 mg/L。【思考题】1、导数光谱法应用于定量的方法有哪些？请详述。 答：导数光谱法是解决干扰物质与被测物质的吸收光谱互相重叠、消除胶体和悬浮物散射影响和背景吸收以及提高光谱分辨率的一种技术。符合 L-B 定律的吸收光谱都可以通过导数光谱法减小误差影响, 在本实验中的新型紫外光谱仪,以及旧型的分光光度计均可使用导数光谱法,定量测量混合溶液中 某组分的浓度。2、吸收光谱的影响因素有哪些？ 答：有如下影响因
7、素(1) 共轭效应：具有至少一个芳环或多个共轭双键的物质在近紫外区域才有吸收,共轭面积越大,波长越大(2) 取代基的性质：芳环上的取代基会引起吸收峰的改变，给电子基(OH、-NH2)会使最大吸收波长红移；吸 电子基(-NO2、-C1)会使使最大吸收波长蓝移；(3) 溶剂的影响：一般溶剂极性增大，n-n*跃迁吸收带红移，n-n*跃迁吸收带蓝移。溶剂极性越大，分子与溶 齐啲静电作用越强，使激发态稳定能量降低。即n*轨道能量降低大于n轨道能量降低，因此波长红移。而 产生n -n*跃迁的n电子由于与极性溶剂形成氢键，基态n轨道能量降低大，n-n*跃迁能量增大，吸收带蓝 移。；(4) pH的影响：例如酚
8、羟基、氨基等在不同酸碱性下会有不同的存在形式：酚羟基在碱性条件下变为-O-, 给电子能力加强，使最大吸收波长红移；-NH2在酸性条件下变为-NH3+,从给电子基团变为吸电子基团， 使最大吸收波长蓝移。3、如何测量氨基酸中酪氨酸的含量，请写出详细的实验步骤 答：与本实验的思路相似，步骤刚好相反，大致步骤如下：(1) 分别移 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL 酪氨酸标准溶液于 5 个 10 mL 比色管中，并用去离子水稀释、定容， 摇匀，待用；(2) 打开仪器，预热、校零、设置仪器参数(同本实验)；(3) 分别绘制步骤色氨酸和赖氨酸在200350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的久；max(4) 定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤(2)中的各标准溶液在久 处的吸光度；绘制色氨max酸和赖氨酸溶液的一至四阶吸收光谱，要求当干扰物质色氨酸的纵坐标数值绝对值小于0.001：(5) 在步骤4同样条件下，测定未知样品溶液在久处
