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1、细胞免疫功能检测常用有哪几种方法一、 迟发型过敏反应的体外检测方法皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（ DTH ）的两种常用方法。皮肤 试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答， 而接触性过敏是测试受者对从未接触过的 物质发生致敏的能力。1皮肤试验 用皮肤试验诊断 DTH ，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD ）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，2448小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于 10mm 即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定 的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差
2、， 也可能受试者从未接触过此抗原， 也可能由于细胞免疫功能缺损， 或由 于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。2接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（ DNCB ）诱发接触性过敏。化合 物与皮肤蛋白质结合而导致 DTH 反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹 DNCB 后间隔 7 10 天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。二、细胞免疫的体外检测方法体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞， 一般使用萄聚糖 -泛影葡胺配成比重为 1.077 的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞 分层液之上离心时，由于红
3、细胞（ 1.092 ）、多形核白细胞（ 1.090）、淋巴细胞（ 1.070 ）的 比重不同而相互分开。 淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。 仔细分出这 一薄层的细胞，其中淋巴细胞占 80% ，单核细胞占 20% ，淋巴细胞中 T 细胞占 80% ， B 细 胞占4%10%，其作为非DT、非B细胞。1 T 细胞计数1）E 花环法：人类 T 细胞表面有 SRBC 受体（ CD2 ）能与 SRBC 结合形成玫瑰花环样结构，将经分层液分离现的 RBM悬液与SRBC在含有血清的平衡盐水中混合， 经37C 培养510分钟放4C过夜，取细胞悬计数，外周血淋巴细胞中约70%80%淋巴细胞结成
4、花环即为 T 细胞。目前此方法已用来分离 T 细胞，而不用做 T 细胞计数。（2）用单克隆抗体计数 T 细胞：将人的 PBM 分成三等份， 分别用小鼠抗人 CD3、CD4 和 CD8 的单克隆抗体作第一抗体与细胞结合，再用 FITC 标记的兔抗小鼠 IgG 抗体作第二 抗体进行间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下或流式细胞仪检测结果，在PBM 中被 CD3抗体染上荧光的细胞称为 CD3 细胞即总 T 细胞。正常人在 PBM 中 T 细胞占 70% 80% 正常人的 CD4 细胞和 CD8 细胞之和应与 CD3 细胞数一致。 CD4 细胞与 CD8 细胞的比 值正常人约为 2/1 而艾滋病患者则比值
5、小于 1.7。2T 细胞活化试验 T 细胞能被非特异的物质称为有丝分裂原所激活而向淋巴母细胞转化。T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最图导致细胞分裂。在光学显微镜下可计数转化后的淋巴细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3HTdR ）掺入正在分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞，用液测量仪检查掺入的 3H-TdR 的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位素，又可用仪器测量的淋巴细胞 增殖反应的检查法，称为 MTT 检测法， MTT 是一种甲氮唑盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底 物，细胞内的酶可将 MTT 分解产生蓝黑色甲（ fromazan ）产物。该产物
6、的多少与活性细胞 数正相关。结果可用酶标检测仪（ 595mm ）测量汇丰银行密度，做为 MTT 法的检查指标。 此法的结果与 3H-TdR 掺入法平行，并能反应试验中的活细胞数。3细胞毒试验 TC 细胞、 NK 细胞、 LAK 细胞、 TIL 细胞对其靶细胞有直接的细胞毒 （杀伤）作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是 51Cr-Na2Cro4 盐水溶液与靶细胞胞混合， 于37C培养1小时左右，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合，洗去游离的51Cr后，51Cr 标记的靶细胞混合（比例约即可得到 51Cr 标记的靶细胞，将待检细胞毒性的细胞与为 50：1 或 100 ：1）靶细胞被杀伤越多，释放
7、到上清液中的液游离的51Cr 越多，且不能被其他细胞吸收。用y射线测量仪检测上清液中的 cpm值，即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。细胞毒试验检测 Tc 细胞效应功能是否健全， 及经 IgG 介导的 ADCC 效应， 或 NK 细胞在抗 肿瘤免疫中的作用是有意义的。4混合淋巴细胞的反应（ MIR） 是体外研究 T 细胞的较好的方法，双向 MLR 常被用 来筛选骨髓移植的供体。 来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞混合培养45天，在最后 8 小时掺入 51TdR 掺入法测 T 细胞的反应性。 或用细胞毒法观察受刺激的 T 细胞与 活的靶细胞混合 （靶细胞来自与刺激细胞相同的个体） 如果 T
8、 细胞受刺激后产生了细胞毒 T 细胞，可杀死活的细胞， 根据靶细胞释放 51Cr的多少算出T细胞移动抑制因子） 和LIF （白 细胞移动抑制因子） 来评估细胞免疫功能。 近年来应用测定 IL-2 的免疫酶技术， 操作简单， 并能定量以取代了 MIF 和 LIF 的测定。单个核细胞与分裂原一起培养 24 小时， 然后测定清 液中的 IL-2 活性。在细胞免疫功能缺损时， 特别是 AIDS 病人， IL-2 分泌明显降低。而有些 疾病，如多发性硬化、类风湿关节炎、移植排斥反应等病人体内血清中IL-2 水平升高，表明病人 T 细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中 IL-2 也可升高。也可用酶联免
9、疫吸附试验测定各种体液中活化的 T 细胞脱落的 IL-2 受体（ CD25 ），一般来 说 IL-2 的水平和 IL-2 受体水平是平行的， IL-2 和 IL-2 受体的检测可用于对某些疾病的监测， 如移杆排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治疗的病人。对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查细胞培养上清液中细胞因子的生物活性或抗原性。现已可用核酸杂交技术，即从组织中或细胞中提取RNA，与同位素或酶标记的该种细胞因子的 cDNA 探针作分子杂交试验，即印迹（ dot blotting ）或 Northern 印迹，若查出有某种因子的能力。mRNA 存在，即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的
