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1、NK细胞和CD8+T细胞对靶细胞杀伤机制的异同自然杀伤细胞（natural killer cell, NK）是先天免疫中的一类十分重要的淋巴细胞，通过其细胞毒活性可以杀伤靶细胞。CD8+T细胞细胞表面表达CD8分子，可以特异的杀伤靶细胞，又称为细胞毒性T细胞或杀伤性T细胞。NK细胞和CD8+T细胞都具有杀伤靶细胞的作用，但它们对靶细胞的杀伤既有相同之处，又有不同之处。本文对NK细胞和CD8+T细胞杀伤靶细胞机制的异同进行了概述。1.NK细胞和CD8+T细胞杀伤靶细胞机制的相同之处 NK细胞和CD8+T细胞都可以通过以下途径杀伤相应的靶细胞：穿孔素、颗粒酶、Fas/FasL、TNF-、INF-和
2、LT途径。1.1穿孔素途径穿孔素（perforin）也称为成孔蛋白(performing pertein, PFP)，NK细胞和CD8+T细胞上都有表达。1988年,Podack 等1报道了人穿孔素的结构和表达,人穿孔素基因定位于10 号染色体10q22，基因全长6218bp ,其cDNA 长为1668bp。人穿孔素蛋白由534 个氨基酸残基组成,其分子量约为6675KD。穿孔素贮存于CD8+T细胞和NK细胞胞浆颗粒中，是CD8+T细胞和NK细胞杀伤靶细胞的主要毒性蛋白。细胞激活后发生脱颗粒（含有穿孔素、颗粒酶等），释放穿孔素。在Ca2+ 的存在下,穿孔素单体可迅速附着于靶细胞膜,嵌入细胞膜的
3、双层磷脂中,多个单体聚合形成打孔聚合物,在靶细胞膜上形成不同孔径(50160nm) 的跨膜孔道,从而导致靶细胞膜去极化。Na+、H2O经过通道进入胞内,一些电解质和大分子物质流出胞外,改变细胞膜渗透压，最终引起靶细胞渗透性死亡。此过程与补体介导的溶细胞过程类似，溶解细胞过程比较迅速。细胞本身可能释放A型硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸软骨素A限制因子，因此可避免穿孔素对自身细胞的攻击。对靶细胞进行攻击后，细胞与裂解的靶细胞分离,又可继续攻击其它靶细胞2。穿孔素还可以通过颗粒酶促进靶细胞凋亡而杀伤靶细胞3。穿孔素形成的传膜孔道有利于颗粒酶进入靶细胞。此外，穿孔素还引起颗粒酶在靶细胞胞浆和胞核的重新分布，
4、使颗粒酶聚集在其裂解部位，有利于裂解靶细胞。1.2 颗粒酶途径 颗粒酶即颗粒相关丝氨酸酯酶，属于糜蛋白酶超家族，在N端具有保守序列4。目前人们已经认识到的颗粒酶有10多种，而研究较多的主要是颗粒酶B。颗粒酶B分子量约为35KD,编码人类颗粒酶B的基因位于人类14q11.2上,含有5个外显子5. 颗粒酶与穿孔素一起贮存于NK细胞和CD8+T细胞的胞浆颗粒中，细胞激活胞吐过程中，颗粒酶和穿孔素一起释放入细胞间隙。颗粒酶可借助于穿孔素在靶细胞上形成的跨膜通道进入细胞中，直接作用于靶细胞核，通过激活半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）级联反应而诱发靶细胞凋亡6。颗粒酶B能活化大多数procaspase
5、，是诱发凋亡能力最强的酶。四肽序列异亮谷苏天冬氨酸是颗B最适意识别单位，也是caspase8和caspase10的识别位点。同时颗粒酶B还可以裂解多聚ADP核糖聚合酶、DNA依赖性蛋白酶和核有丝分裂器等核底物，直接引起细胞凋亡。Sutton等7认为,Bcl2 可阻断由颗粒酶B和穿孔素引起的细胞凋亡。颗粒酶和穿孔素还可以通过细胞内非caspase依赖性途径诱发细胞凋亡，这种作用不被病毒产物CrmA 所抑制，而颗粒酶caspase依赖性细胞毒作用可以被病毒产物CrmA 所抑制3。Shi等8发现尽管颗粒酶B也能自主进入靶细胞,不需要穿孔素的辅助,但穿孔素对凋亡过程的起始和颗粒酶B 进入核内有关键作用
6、。纯化的颗粒酶B 以及其它颗粒酶单独存在不能引起靶细胞凋亡。1.3 Fas/FasL途径Fas分子也称为APO1或CD95，属于型跨膜糖蛋白，含有335个氨基酸残基，分子量约为45000500009。Fas分子膜外部分的氨基酸序列与肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体同源，可以与Fas配体或抗Fas抗体结合并将刺激信号传入膜内部分；膜内部分与TNFR1的膜内部分同源。FasL是型跨膜糖蛋白,呈球状三聚体结构,与TNF 超分子家族具有同源性10。FasL全长278个氨基酸残基，经过糖基化的FasL分子量为3643KD。细胞受到抗原刺激或在IL-2存在的条件下，其表面可以迅速地被诱导出FasL。当F
7、asL与Fas结合时，Fas可以向细胞传递死亡信号，数小时内细胞凋亡11-13。Fas的凋亡信号主要是通过与其胞浆区相关的死亡结构域蛋白（FADD）介导的。Fas与FasL结合后，受体发生多聚化，胞浆区的死亡结构域蛋白（DD）也发生多聚化，使得位于胞浆内的FADD可以通过其C端的DD与受体胞浆的DD结合。FADD一方面通过C端的DD结合Fas，另一方面通过N端的死亡反应结构域（DEM）与caspase8 N端的DEM结合，通过caspase8诱导效应性caspase蛋白酶的激活，降解自身的DEM并最终导致细胞凋亡的发生。Fas/FasL途径与穿孔素颗粒酶途径是相互独立的。去处穿孔素基因小鼠的C
8、TL, 或无穿孔素表达的CTL 细胞素均可通过Fas 途径杀伤靶细胞14; 而FasL 基因突变小鼠CTL 无活性FasL 表达, 但仍可通过穿孔素-颗粒酶途径杀伤15。同时Fas/ FasL途径与穿孔素颗粒酶途径杀伤靶细胞作用有一定的区别16， 前者主要删除活化T细胞和NK细胞，作用较迅速（4小时），无Ca2+依赖性，具半胱天冬氨酸依赖性。后者主要清除病毒感染细胞、恶性转化细胞及异体细胞，作用反应迅速（分秒）， 具有Ca2+依赖性及部分（核效应） 半胱天冬氨酸酶依赖性。1.4 TNF-途径人TNF-前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型TNF-为157氨
9、基酸残基，非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。小鼠TNF-前体为235氨基酸残基，信号肽79氨基酸残基，成熟的小鼠TNF-分子量为17kDa，由156个氨基酸残基组成，第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能。人的TNF-基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群密切连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上17。NK细胞和CD8+T细胞都可以分泌细胞因子TNF-，TNF通过改变靶细胞溶酶体的稳定性，导致多种水解酶外漏；影响细胞膜磷脂代谢；改变靶细胞糖代谢使组织中p
10、H降低；以及活化靶细胞核酸内切酶，降解基因组DNA从而引起程序性细胞死亡等机理杀伤靶细胞18。TNF引起细胞死亡过程要明显慢于穿孔素溶解细胞的作用过程。1.5 INF-途径人INF-成熟分子由143个氨基酸组成，糖蛋白，以同源双体形式存在，分子量为40kDa；小鼠成熟IFN-分子由133个氨基酸残基组成，IFN-生物学作用有严格的种属特异性。人和小鼠IFN-基因分别定位于12号和10号染色体，在DNA水平上IFN-基因与IFN-/基因无同源性。人和小鼠IFN-在DNA水平上有65%左右同源性，在氨基酸水平的同源性只有40%左右3。NK细胞和CD8+T细胞可以通过INF-来间接杀伤靶细胞。INF
11、-活化巨噬细胞，使其杀伤寄生虫和胞内寄生菌的能力显著增强。1.6 LT途径NK细胞和CD8+T细胞都可以分泌淋巴毒素（lymphotoxin, LT），LT与靶细胞表面的相应受体结合后向细胞内移，继而被溶酶体摄取，导致溶酶体稳定性下降，各种溶酶体酶外逸，直接引起细胞溶解。LT也可与靶细胞表面的TNF R1结合，通过受体胞浆区的DD传递靶细胞凋亡信号3。2. NK细胞和CD8+T细胞杀伤靶细胞机制的相异之处 杀伤过程的不同之处杀伤靶细胞过程中，NK细胞和CD8+T细胞对靶细胞的识别方式、颗粒产生方式及杀伤特性是不同的。CD8+T细胞识别靶细胞是受MHC-类分子限制的，由TCR将特异的识别。而NK
12、细胞虽然也可以通过表达的KIR，CD94/NKG2等受体识别靶细胞上的MHC-类分子，但其也可通过NKR-P1家族识别靶细胞上的某些碳水化合物，或其他粘附分子识别靶细胞，因此NK细胞是非MHC-类分子限制的19。MHC-类分子丢失的病毒感染细胞对CD8+T细胞不敏感而对NK细胞变得更敏感。NK细胞和CD8+T细胞产生穿孔素/颗粒酶颗粒的方式是不同的19。NK细胞本身存在这种颗粒，而静止的CD8+T细胞中不存在这种颗粒。CD8+T细胞只有与靶细胞上特异的MHC-和抗原的复合物识别后，或受到IL-2等刺激的情况下，才会在胞浆内产生这种颗粒。NK细胞的杀伤功能属于先天免疫，特异性差，其对靶细胞的杀伤
13、作用出现的早，在体外1小时、体内4小时及见杀伤效果。而CD8+T细胞对靶细胞的杀伤属于细胞免疫，从前提细胞诱导成成熟的效应T细胞需要一个应答过程，一般需要一周以上，但其识别和杀伤具有特异性，而且免疫力维持时间较长。2.2 NK细胞杀伤靶细胞的机制ADCC途径NK细胞表达的FcRA (CD16)主要结合人的IgG1和IgG3的Fc端（C2、C3功能区），在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下，可杀伤相应的靶细胞，这一杀伤过程称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC）3。IL-2和IFN-明显增强NK细胞
14、介导的ADCC作用。NK细胞发挥ADCC后，其本身表达Fas并可通过Fas/FasL机制发生化活诱导的细胞死亡。2.3 CD8+T细胞杀伤靶细胞的机制2.3.1 Leulalexin途径Leulalexin又称TNF相关蛋白，CD8+T细胞的胞浆颗粒(分泌型)和细胞膜表面（膜结合型）均表达leulalexin20。存在于胞浆颗粒的分泌型leulalexin进入靶细胞的过程及发挥作用的过程都依赖于穿孔素，可介导靶细胞凋亡。膜表面的结合型leulalexin可通过细胞细胞直接接触杀伤靶细胞，其机制可能类似于FasL。2.3.2 丝氨酸酯酶途径活化的CD8+T细胞可释放多种丝氨酸酯酶，如CTLA-1
15、、CTLA-3等，它们的作用可能类似与参加补体激活的酯酶样成分，通过激活穿孔素而促进杀伤靶细胞3。综上所述，NK细胞和CD8+T细胞对靶细胞的杀伤既有相同点也有不同点。相同点主要集中在两者都可以通过穿孔素、颗粒酶、Fas/FasL、TNF-、INF-和LT途径杀伤靶细胞；杀伤不同点包括两者对靶细胞的识别方式、颗粒产生方式及杀伤特性不同，NK细胞可以通过ADCC杀死靶细胞，CD8+T细胞可以通过leulalexin和丝氨酸酯酶途径杀伤细胞。 参 考 文 献1 Podack ER, Lowrey DM, Lichtenheld M, et al. Structure, function and expression of murine and human perforin 1 (P1).Immunol Rev, 1988,103:203-11.2 刘培军.穿孔素研究紧张.国外医学免疫学分册,2021,25(2):69-72.3 金伯泉.细胞和分子免疫学(第二版).北京:科学出版社,2021.4 Podack ER, Konigsberg PJ. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural, b
