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1、 血凝抑制实验报告 禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于推断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物安康组织进展全球流感监测所普遍采纳的方法，而且因其具有经济、快速、牢靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水公平优点，已经成为当前基层兽医试验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，常常因操作不标准、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现依据几年来的工作阅历对该试验过程中应留意的事项做一探讨。 一、血凝试验操作程序 1、取96孔90V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的112孔每孔加
2、25LPBS液。 2、吸取25L标准禽流感抗原参加到第一排第1孔中充分混匀。 3、从第1孔吸取25L混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25L参加到第3孔中，依次进展倍比稀释至其次排最终一孔即第24孔，最终弃去25L。第三排孔至第四排孔同上操作。 4、依次向第一至第五排孔的每孔中参加25L1%的鸡红细胞悬液。 5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25）静置30min观看结果（假如环境温度太高，可置4环境下）。 6、结果判定：将板作45倾斜，观看红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU） 二、血凝抑制试验操作程序 1、依据血凝试验结
3、果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第112孔各参加25LPBS。 3、在第1孔参加25L被检血清，充分混匀后移出25L加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25L。 4、按以上步骤参加阳性血清和阴性血清（各做两份），作对比孔。 5、在第112孔各参加25L4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25下静置30min。 6、每孔参加25L1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25）静置40min后观看结果，若环境温度过高，可于4条件下进展，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。 7、结果判定：只有阴性对比孔血清滴度不大于
4、2log2，阳性对比孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。将酶标板作45倾斜，以完全抑制红细胞凝集的稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。 三、试验过程中的留意事项 1样品的保存及试验前处理 1.1采集的血液样品应准时分别血清，分装至离心管中，标记清晰，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并制止运输过程中猛烈震惊。 1.2一般状况下，在5天内检测的样品可放置在4的冰箱中冷藏，否则低温冷冻保存。 1.3在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采纳上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌猛烈振荡而引起产生气泡及血清中蛋白变性。 1.4对消失胶冻状的血清样品，可采纳
5、反复搅动几下再离心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原的血清，可能是由于放置时间不够造成的血清未完全析出状态。不建议直接吸取其中少量的清亮血清。 1.5水禽等样品为排解非特异性反响，还应相应进展灭能反响。详细操作方法：56水浴锅30min或加等量10%鸡红细胞，轻摇后静置30分钟，离心，收集上清液即可。 2器材的选择 2.1酶标板的选择： 建议使用96孔90V型板进展试验，通过反复试验证明：90V型板相对于110板及130板来讲，具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清楚、结果简单判定等优点。 2.2移液枪的选择及使用： 单道、多道可调微量移液枪应选择适宜的量程，以便准确度的提
6、高。 使用时应采纳一档吸液二档排液的方法。吸取液体时，枪头要深入液下缓慢平稳吸液。加缓冲液时应加在板孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合匀称，还应留意尽量避开产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免穿插污染，影响试验结果。 加样、倍比稀释时应高度集中留意力，以免漏加、重复加样等。 3试剂的保存及配置 3.1禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格根据说明书的要求进展保存和配置，试验前应提前将其恢复至室内温。抗原的保存温度为-20，反复冻融会降低抗原的滴度，应避开反复冻融。 3.2PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制备。 应尽量现用现配。
7、每次使用前应测PH值，以免时间过长而导致PH值发生转变。 由于PH试纸跨度范围偏大，PH值不易精确介定，因此采纳酸度计精确测量PH值，以提高试验的准确度。 全部试验均采纳同一种稀释液。 3.31%红细胞的制备。 为避开有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应选择实行2-3只SPF鸡或未进展过任何免疫过的成年公鸡血液。固然采血的前提条件是要按非常之一采血量比例在一次性注射器中参加抗凝剂，如肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。 采血完毕后分装至2ml容量的圆底离心管中，由于通过2ml与1.5ml两种容量离心管相比拟，放入1.5ml尖底离心管中的话，离心后，离心管底部红细胞不易与参加的PBS液
8、混匀，易沉积在管底部，达不到洗脱洁净的目的。 经20xx3000r/min，510min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再参加十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞裂开），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透亮为止。 在加红细胞过程中还须不断轻摇以确保红细胞匀称，使其每孔参加一样数量的红细胞。 制备好的红细胞液假如放置后上清液变红，说明有溶血，不行再使用。 3.4抗原液的配制 先做血凝试验测定效价，以抗原与红细胞完全凝集的孔为1HUA抗原，配制4HUA抗原应往前推算两孔，即除以4后的值。 每次做试验前，必需重新检测禽流感抗原的血凝效价，以免效价发生转
9、变而导致抗原稀释倍数不精确，从而导致试验结果不精确。 为保证配制的抗原精确，还要进展抗原回滴试验。详细方法：做二排抗原回滴，在两排的第18孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在两排的第1、第2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第4孔，弃去25微升，另一排同样。从第2至第8孔补25微升PBS，以保持75微升总量不变，另一排同样。两排的第1至第8孔各加25微升1%红细胞，震荡10秒钟。静置30分钟观看结果。这样在第1孔为4HAU抗原，第2孔为2HAU抗原，第3孔为1HAU抗原，第4孔为1/2HAU抗原，均为75微升总量，第5至第8孔为空白对比。假如抗原回滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回滴
10、试验成立。由于假如抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，假如抗原浓度过低，则所测定的效价偏高。所以不调整抗原浓度至试验成立的话会对结果有很大影响。 4结果的判定 每次试验必需设阳性及阴性（空白）对比血清，判别试验是否成立。判读结果时，将酶标板倾斜45，以孔底沉淀的红细胞流淌性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。 5试验器具的清洗 每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净，然后用自来水反复冲净每个孔，再放入3%NaOH中4小时，清水反复冲净，再放入3%Hcl中4小时，清水反复冲净，再用蒸馏水反复冲洗几次，甩干水份，入枯燥箱中枯燥备用。试验用烧杯、加样槽、量筒等也应充分洗净、枯燥。以免
11、器具内有杂物、污物以及残留物从而影响试验结果。 四、小结 在进展禽流感血凝抑制试验时，应充分考虑到各方面的影响因素，供应的检测结果才会真实牢靠，精确把握禽类的免疫抗体水平，进而为科学防控禽流感供应理论依据。 血凝抑制试验报告2 一、原理 流感病毒颗粒外表的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞外表受体的构造，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而消失抑制现象。 二、应用 该试验是目前WHO进展全球流感监测所普遍采纳的试验方法。可用于流感病毒分别株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型全都的感染或免疫抗体。 三、缺点 只有当抗原
12、和抗体HA亚型相全都时才能消失HI现象，各亚型间无明显穿插反响；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进展抗原标准化；需要正确判读的技能。 四、试验步骤 1阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1， 69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4保存备用,保存期1个月）。 210%和1%鸡红细胞液的制备 2.1采血 用注射
13、器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（假如没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约24mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。 2.2洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经15001800 r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物参加阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经15001800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，参加阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4保存备用，不超过5天。 2.310%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过5天的
14、红细胞，在锥形刻度离心管中离心15001800 r/min 8分钟，弃去上清液，精确观看刻度离心管中红细胞体积(mL)，参加9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合匀称。（此步 可省略，直接配制1%红细胞） 2.41%鸡红细胞液 取混合匀称的10%鸡红细胞悬液1 mL，参加9 mL生理盐水，混合匀称即可。（依据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml/每份血清） 3抗原血凝效价测定（HA试验，微量法） 3.1在微量反响板的1孔12孔均参加25l PBS（生理盐水），换滴头。 3.2吸取25l抗原参加第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取25l，病毒液参加第2孔，混匀后吸取25l参加第3孔，如此进展倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25l弃之，换滴头。 3.4每孔再参加25l PBS（生理盐水）。 3.5每孔均参加25l体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后参加）。 3.6振荡混匀，在室温（2025）下静置40min后观看结果（假如环境温度太高，可置4环境下反响1小时）。对比孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。
