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1、利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要 利用套叠PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶切位 点。将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体pGAPZa-A的a- factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZa-A/Insulin重组分泌表达载体。表达载体用Bin I线 性化处理后电击转化毕赤酵母 GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。 SDS2PAGE和Native2PAGE的分析表明：蛋白在分泌表达过程中，加入Insulin的A链 (2.4k )和B链(3.4k )之间的Kex2酶切位点发挥了作用，Kex2蛋白酶将A链和B链切
2、开，在a-factor信号肽的作用下通过分泌途径将A链和B链分泌到胞外，同时A链和B链又 以二硫键形成了高级结构。WesternBlot结果表明：重组蛋白能够与鼠抗人Insulin抗体发生 特异性反应，具有与天然Insulin相同的免疫原性。通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕 赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优 化；根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集Abstract : Use n ested PCR syn thesis of recomb inan
3、t huma n in suli n gene, join Kex2 cleavage sites betwee n the A and B cha ins. The syn thetic recomb inant huma n in suli n gene in the correct reading frame was inserted into the constitutive secretory expression vector pGAPZa-A a-factor sig nal peptide seque nee Preparati on the con struct pGAPZ
4、a-A/I nsuli n recomb inant secretory expressi on vector. The expressi on vector lin earizati on Bln I treated electroporati on compete nt cells of Pichia pastoris GS115 con structed expressi on of secretory In sulin engin eered bacteria.The an alysis SDS2PAGE and Native2PAGE showed that: the protein
5、 in the process of secretion expression added Insulin A chain (2.4k) and Kex2 cleavage sites betwee n the B-cha in (3.4k) played a role, Kex2 protease of the A and B cha ins cut through the secretory pathway in the role of thea-factor sig nal peptide of the aand B cha ins secreted into the extracell
6、ular doma in, while the a-cha in and B-cha in disulfide bond formation Youyi advaneed structure. WesternBlot: The results show that the recomb inant protein was able to specifically react with mouse an ti-huma n In suli n An tibodies having the same natural Insulin immunogenicity. By single factor a
7、nalysis and orthogonal experiment method of high density fermentation of Pichia pastoris medium screening and optimization; optimized culture conditions of the high-level expression of human growth hormone; according flask fermentation optimization results the fed-batch fermentation; prelim inary id
8、e ntificatio n of the expressi on product.Keywords: recomb inant huma n in suli n, Pichia pastoris, secreti on of expressi on, media optimizati on, crystal collecti on胰岛素是治疗糖尿病的常用特效药物，有很 大的市场需求，以往主要是从猪、牛胰脏中 提取，近年来重组人胰岛素已占领了市场的 大部分份额。人胰岛素是首先在微生物中表 达的蛋白之一。从1977年以后，在大肠杆菌 和酵母中表达的重组人胰岛素在治疗中就取 代了动物胰岛素。在大肠
9、杆菌中表达的人胰 岛素表现为单链或胰岛素原，它通常形成包 涵体，在发酵后会变性和重折叠。在酵母中，能表达胰岛素单体或是二聚体，通过二 硫键的正确配对形成正确折叠的产物，后经 过酶切转化成人胰岛素。巴斯德毕赤酵母以 其独特的生物学和遗传学特征成为当今一种 诱人的的外源基因表达系统，本文对人胰岛 素的性质、巴斯德毕赤酵母基因表达系统的 特点、菌体的大规模培养、研究进展及其对 胰岛素基因的表达作一简要综述。1材料与方法1.1材料1.1.1质粒和菌种 pGAPZa-A表达载体、 E.coli ToplOF 、 E.coli DH5 a、 P.pastoris GSll5 均为 Invitrogen 公
10、司产品，pMD18-T EasyVector 购自 Takara 公司。1.1.2 生 化试剂 抗生素zeocin为 Invitrogen公司产品，TaqDNA聚合酶、10x Taq buffer、限制性内切酶（Bln I、Xho I和 Xba I ）以及T4 DNA连接酶均购自TaKaRa 公司。DNA回收试剂盒、DNAMarker购自 Tiangen。蛋白质分子质量标准购自Solarbio 公司。一抗 rat anti-human Insulin 购自北京 赛驰生物科技有限公司，二抗 goat anti-rat IgG-HRP购自Tiangen公司。其它试剂均为 国产分析纯。1.1.3培养
11、基 细菌培养基为LB培养基，酵 母平板培养基为YPD培养基，酵母种子培养 基为BMGY培养基，酵母分批发酵培养基， 酵母补料生长培养基，酵母诱导培养基，酵 母鉴定培养基。固体培养基为在液体培养基 中加入1.5%的琼脂粉。121 9高温灭菌 20min。考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL ,滤纸 过滤，最终试剂中含0.01%( w/v )考马斯 亮蓝 G-250 , 4.7%( w/v )乙醇，8.5%( w / v )磷酸。标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋 白用0.15mol / L NaCI配成lm
12、g / mL蛋白溶 液。1.1.4器材分析天平、高压灭菌锅、恒温震荡培养箱、 12.8L搅拌发酵罐、分光光度计、精密pH仪、高速冷冻离心机、生化培养箱、超级工 作台、电泳仪、尾气分析仪、紫外检测仪、 凝胶成像系统、F l e x S t a n d 中空纤维中 试切向流系统、Q u i x S t a n d中空纤维切 向流系统1.2方法1.2.1 Insulin基因片段的合成及连接1.2.1.1基因片段及引物设计与合成 根据 In2sulin氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱密码 子，分3段合成Insulin基因：(1 ) Insulin 基因片段 1 ( Ins1 ) : 5- tttgtgaa
13、ccagcatttgtg tggttctcat ctggtggaag ctttgtacct cgtgtgtggtgag-3;(2 ) Insulin 基因片段 2 ( Ins2 ) : 5- ttgctccacgatacc tcttt ggtcttagg agtgtagaaa aaccctctct caccacacac gag-3 ; Kex2(3 ) Insulin 基因片段 3 ( Ins3 ) : 5- gttacagtag ttttccagtt ggtagagaga acagatagag gtgcaacatt gctccacgat acc-3;(4 )引物 1 ( P1 ): 5-ta
14、 ctcgagaaaaga tttgtgaaccagcat ttgt-3;XhoI Kex2(5 )引物 2 ( P2 ) : 5 -gaggtgcaac attgctccac gatacc-3;(6 )引物 3 ( P3 ) : 5 -gc tctagact attagttacagtagttttcc agt-3;XbaIIns1片段斜体划线部分与Ins2片段斜体划线 部分互补，引物P1和P3分别引入Xho I和 Xba I酶切位点，在P1和Ins2中各引入1个 Kex2蛋白酶切位点。基因片段及引物均由上 海生工生物工程有限公司合成。1.2.1.2 套叠PCR连接Ins1和Ins2基因片 段利
15、用Ins1和Ins2部分互补及引物P1、P2 进行PCR反应，PCR采用25pl反应体系， 10 x Taqbuffer (含 200mmol/L Tris-HCl pH8.4 ; 200mmol/L KCl ; 100mmol/L (NH4 ) 2SO4 ; 15mmol/L MgCl2 2.5pl，特 异引物P1、P2和Insulin基因片段Ins1、 Ins2 (浓度为 25pmol/L )各 0.5pl , Taq 酶 1.25U , 2.5mmol/L dNTP 2 p l ,最后力口 ddH2O将体积调整为25pl。在同一个PCR 反应中，采用不同的退火温度，先使Ins1和 Ins
16、2退火延伸，再用P1和P2进行扩增，得 到Ins1-Ins2片段。PCR程序如下：949 5min ; 94C300s , 43C30s , 72C30s , 10 个循环；94C30s , 47C30s , 72C30s , 20 个循环；72C, 7min ; 4C保存。回收PCR 产物，用于下步实验。1.2.1.3 套叠PCR连接Ins1-2和Ins3基因 片段利用Ins1-2和Ins3两个片段的互补及引 物P1、P3，反应体系同1.2.1.2，采用不同 的退火温度扩增得到Insulin全长。PCR程序 如下：94C5min ; 94C30s , 37C30s , 72C 30s , 10 个循环；94C30s , 47C30s , 72C 30s , 20 个循环；72C7min ; 4C保存。 PCR扩增结束后，在2.0%琼脂糖凝胶中进行 电泳并回收扩增产物，获Ins1-Ins2-I
