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1、环境微生物学实验讲义化学化工与食品安全学院 环境科学与工程系2012.6目 录 实验一 显微镜的结构与使用 1实验二 革兰氏染色实验 6实验三 酵母细胞数量及出芽率的测定血球计数板法8实验四 培养基的配制及灭菌 11实验五 空气中微生物的计数沉降法 13实验六、土壤中微生物的分离、培养 15实验七 纯培养菌种的菌落、菌体形态观察 172环境微生物学实验讲义实验一 显微镜的结构与使用一、目的要求1了解普通光学显微镜的构造和原理。2正确掌握使用显微镜的方法。二、基本原理显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成（图1-1）。光学显微镜的构造(图1-1)1. 物镜转换器 2. 接物镜 3.游标卡尺 4.
2、载物台 5.聚光器 6. 彩虹光阑 7.光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋 12. 微调螺旋 13. 镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋1机械装置镜座（base）和镜臂（arm）镜座位于显微镜底部，呈马蹄形，它支持全镜。镜臂有固定式和活动式两种，活动式的镜臂可改变角度。镜臂支持镜筒。镜筒（body tube）是由金属制成的圆筒，上接目镜，下接转换器。镜筒有单筒和双筒两种，单筒又可分为直立式和后倾式两种。而双筒则都是倾斜式的，倾斜式镜筒倾斜45。双筒中的一个目镜有屈光度调节装置，以备在两眼视力不同的情况下调节使用。转换器（no sepiece
3、）为两个金属碟所合成的一个转盘，其上装34个物镜，可使每个物镜通过镜筒与目镜构成一个放大系统。载物台（stage）又称镜台，为方形或圆形的盘，用以载放被检物体，中心有一个通光孔。在载物台上有的装有两个金属压夹称标本夹，用以固定标本；有的装有标本推动器，将标本固定后，能向前后左右推动。有的推动器上还有刻度，能确定标本的位置，便于找到变换的视野。调焦装置 是调节物镜和标本间距离的机件，有粗动螺旋（coarse adjustment）即粗调节器和微动螺旋（fine adjustment）即细调节器，利用它们使镜筒或镜台上下移动，当物体在物镜和目镜焦点上时，则得到清晰的图像。2光学系统物镜（objec
4、tive）物镜安装在镜筒下端的转换器上，因接近被观察的物体，故又称接物镜。其作用是将物体作第一次放大，是决定成像质量和分辨能力的重要部件。物镜上通常标有数值孔径、放大倍数、镜筒长度、焦距等主要参数。如：NA030；10；160/017；16mm。其中“NA030”表示数值孔径（numerical aperture，简写为NA），“10”表示放大倍数，“160/017”分别表示镜筒长度和所需盖玻片厚度（mm），16mm表示焦距。目镜（ocular lens）装于镜筒上端，由两块透镜组成。 镜把物镜造成的像再次放大，不增加分辨力，上面一般标有7、10、15等放大倍数，可根据需要选用。一般可按与物镜
5、放大倍数的乘积为物镜数值孔径的500700倍，最大也不能超过1000倍的选择。目镜的放大倍数过大，反而影响观察效果。聚光器（condenser）光源射出的光线通过聚光器汇聚成光锥照射标本，增强照明度和造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器由聚光镜和虹彩光圈（iris diaphragm）组成，聚光镜由透镜组成，其数值孔径可大于1，当使用大于1的聚光镜时，需在聚光镜和载玻片之间加香柏油，否则只能达到10。虹彩光圈由簿金属片组成，中心形成圆孔，推动把手可随意调整透进光的强弱。调节聚光镜的高度和虹彩光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。光源（light source）较新式的显微镜其光源通
6、常是安装在显微镜的镜座内，通过按钮开关来控制；老式的显微镜大多是采用附着在镜臂上的反光镜，反光镜是一个两面镜子，一面是平面，另一面是凹面。在使用低倍和高倍镜观察时，用平面反光镜；使用油镜或光线弱时可用凹面反光镜。滤光片（filter）可见光是各种颜色的光组成的，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色的，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。三、基本原理微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，40
7、45）和油镜（18 mm，95100）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI（oil immer-sion）字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大10002 000多倍。从图-3中可看出油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=152，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物
8、镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度（图1-2）。(图1-2)利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NAnsin式中 NA=数值孔径；n=介质折射率；=最大入射角的半数，即镜口角的半数。因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为90，sin90=1，故以空气为介质时（
9、n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120，其半数的正弦为sin60=087，则：以空气为介质时：NA=1087=087以水为介质时：NA=133087=115以香柏油为介质时：NA=152087=132显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小
10、分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。式中=光波波长。我们肉眼所能感受的光波平均长度为055m，假如数值孔径为065的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为042m。而在042m以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为125的油镜时，能辨别两点之间的因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=065），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有042m。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=125），和放大率为9倍的
11、目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出022m间的距离。四、材料与器材显微镜、香柏油、擦镜纸、吸水纸等。细菌，酵母菌，霉菌等标本。五、实验步骤1观察前的准备（1）1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。（2） 将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。（3） 调节光照:不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈打开到
12、最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。2低倍镜观察镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像
13、并将它移到视野中央进行观察。3.高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察,并准备用油镜观察。4油镜观察（1）用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。（2）在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。（3）从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损
14、坏镜头。（4）从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。5. 观察完后复原下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醇擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。【注意事项】1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。4.观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。5.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 思考题1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜
