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1、阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展黄柯鑫 综述，赵 斌 审校（广东医学院神经病学，广东 湛江 524023）【摘要】 目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体的转染效率最高, 但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用。阳离子脂质体是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体。其生物膜特性，能使其转运的基因保持生物活性，保护基因免受溶酶体的降解，且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点，而成为世界性的研究热点。【关键词】阳离子脂质体；转染；转染效率；影响因素The advancement about factors
2、 contributing to the transfection efficiency of cationic liposome HUANG Ke Xin, ZHAO Bin. (Neurology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524000,Guangdong,CHINA)【Abstract】At present, there are two kinds of vectors in gene transfection: virus vector and non- virus vector. Virus vector has a better t
3、ransfection efficiency, however, it is limited in widely use by its infectibility and carcinogenicity. Cationic liposome is a non-virus vector, which has an outstanding developing prospect. Its biological membrane characteristic can maintain the transported genes biological activity by preventing ly
4、sosomes degradation. Furthermore, it is famous for no immunogens, easy for operation, no restrictions length of the gene, high reproducibility and biodegradation. So it becomes a hot spot in the world.【key words】cationic liposomes; transfection; transfection efficiency; factors contributing to20世纪80
5、年代，Felgner等首次通过实验证明了阳离子脂质体可用于DNA转染。近年来，基因转染技术在生物学研究领域和临床应用都已取得了很大的进展。阳离子脂质体安全性好、操作简单，被广泛用于DNA、RNA的细胞转染。阳离子脂质体在基因转染的成功运用，显示出广阔的前景；然而，阳离子脂质体参与体内外基因转染的过程中，受到诸多因素的影响，现就其进展综述如下：1 脂质体介导的基因转移机制 阳离子脂质体介导的基因转染主要通过胞吞作用进入细胞内，其机制可简述为：带正电的阳离子脂质体通过静电作用与带负电的基因 (DNA或RNA)形成脂质-基因复合物(lipoplexes, 简称脂质复合物)，阳离子脂质体表面过剩的正电
6、荷通过静电作用吸附于带负电的细胞膜上1，而脂质体本身具有的亲脂性，使脂质复合物通过细胞内吞或细胞膜融合作用进入细胞内形成内涵体；脂质复合物在细胞质中或进一步传递到细胞核内释放基因，从而在细胞内转录和翻译。2 影响阳离子脂质体转染效率的因素2.1 阳离子脂质体的构型 探究阳离子脂质体的构效关系，对提高其转染效率有着重要的意义2。阳离子脂质体通常由一个阳离子两性化合物(即细胞转染素和一个中性（或兼性）辅助磷脂组成。常用的辅助磷脂有二油酰磷脂酰乙醇胺 ( DOPE)、1, 2二油酸甘油3磷脂酰胆碱 ( DOPC )、二棕榈酰磷脂酰胆碱 ( DPPC) 、胆固醇 ( Chol)、磷脂酰胆碱 ( PC
7、) 等。细胞转染素与辅助磷脂结合能形成稳定的双层膜结构，降低阳离子头部的毒性作用，同时为阳性脂质提供细胞渗透功能，因此，中性辅助脂成分可增强阳离子脂质体的转染活力3。其中，中性磷脂DOPE的细胞膜去稳定化作用，能直接诱导脂质体膜与内涵体膜融合，从而使DNA迅速释放。研究发现，阳离子脂质单体有锥形、非反转六角形 (Hphase) 和反转六角形 ( Hphase)等不同空间构型，当膜融合作用占优势时Hphase的结构形式最利于转染 4。 2.2 阳离子脂质体的制备 除了阳离子脂质体本身的构型特点外，脂质体的制备差异，对脂质体/DNA复合物的结构和稳定性也起到重要的影响，进而影响转染效率。在体内转染
8、中，阳离子脂质体从溶酶体释放进入细胞质的速率，对转染效果有着直接的影响。在阳离子脂质和中性辅助磷脂这两种成分的基础上,添加其它的辅助材料，也可提高脂质体的转染效率。Shigeta等5合成了新型的组氨酸-半乳糖化胆固醇衍生物Gal2His2C42Chol (2) ，具有“质子海绵效应”，能加速阳离子脂质体从溶酶体释放、进入细胞质的过程，从而使细胞的转染效率明显提高。2.3 DNA的大小及构型 研究表明质粒DNA的大小对转染效率有很大影响6。 Katrien等7以DOTAP/DOPE阳性脂质体为基因载体，将3种构型的质粒DNA分别转染Vero细胞，结果发现超螺旋质粒DNA的转染效率最高。Lukac
9、s等8通过对Hela细胞的实验发现小于100bp的DNA片段可以在细胞的细胞质中自由移动。而随着DNA片段的增大，其在细胞质中的迁移能力也随之降低。这是由于核孔对于进入细胞核的DNA具有“尺寸限制功能”。2.4 脂质体/DNA复合物的正负电荷比例 脂质体/DNA复合体中两者的正负电荷比例是影响基因转染效率的重要因素。其中的一个重要原因是，两者所带电荷比例可直接影响复合体的粒径；而当lipoplexes的直径尺寸在0.4m 1.4 m范围内时，具有更高的转染效率9。Almofti 等10通过电镜观察发现，当脂质体 /DNA复合体的电荷比值为1时粒径最大,认为电荷比值为1时, 脂质体与DNA 静电
10、斥力消失，易于集聚，大于或小于1时，产生静电排斥作用使脂质体 DNA 均匀分散。实验证明, 脂质体与DNA的电荷比在11时，形成的复合体的粒径最大，在体内的半衰期延长，基因转染效率最高。另外，带有稍微过剩阳离子的lipoplexes，其转染效率更高11。2.5 脂质体/DNA复合体的大小 阳离子脂质体带正电荷，核酸大分子带负电。当两者混合时，可在瞬间发生相互作用而形成脂质体/DNA复合体lipoplexes12。lipoplexes 的大小和形状受阳离子脂质体和 DNA 的摩尔比影响，且呈动态变化。当正负电荷比例接近1 时，则有明显的大小及结构的改变13。Rejman等142004在研究复合体
11、的粒径对细胞内吞作用的影响时发现，粒径在200nm1m之间的粒子，其通过细胞膜内陷作用进入细胞的过程比较缓慢，使得DNA在到达溶酶体之前就从核内体中释放出来，避免其在溶酶体内降解。而粒径小于200 nm的复合体在进入细胞后,迅速被转运至溶酶体内并发生降解。2.6 生物学因素 2.6.1 细胞外干扰因素 在血清环境中脂质体/DNA复合物的转染效率较低，其中一个很重要的原因是，血清蛋白中和了脂质体/DNA复合物表面的正电荷，使其与带负电的细胞表面的静电作用受到影响。Xu等15通过实验观察推测，血清和血浆成分可能使脂质体/DNA复合物过早地发生聚集、结构改变与分解。针对此现象，有研究者用聚乙二醇等作
12、为修饰成分，屏蔽阳离子脂质体表面过多的正电荷，从而抑制复合体的聚集，同时可阻止lipoplexes与带负电的血清蛋白相互作用16使复合体逃避巨噬细胞的清除。2.6.2 细胞内干扰因素 目前普遍认为抑制DNA从核内体中释放的因素以及DNA进入细胞核的干扰因素，均对阳性脂质体介导基因转染产生重要影响。细胞在有丝分裂时，外源性DNA更容易被细胞核摄取17。由此认为，DNA 进入细胞核的一个主要机制是依赖于细胞分裂时的有丝分裂被动进入胞核。但对神经元细胞的成功转染提示DNA也可以通过主动运输穿过核膜。然而，在非有丝分裂的细胞中，粒径比核孔大的DNA穿过核孔的机制还尚未清楚17。此外，脂质体的转染效率还
13、跟转染时间、转染细胞的类型、转染细胞的生长状态及融合程度等因素有关。前景展望：在一系列非病毒载体中，阳离子脂质体介导的基因传递系统是最有前景的传递系统之一。目前研究者发现针对不同的靶细胞寻找高特异性的靶向性配体具有广阔的前景18。例如，利用不同性能的分子材料，如亲水性阳离子聚合物、表面活性剂、糖蛋白和多糖等对脂质体表面进行修饰，可在生物体内的某个过程起到调控作用，从而提高转染效率。脂质-复合物进入细胞膜的调节机制是基因转染过程一个重要的限速步骤，如果能从信号分子以及具体作用机制的角度，详细阐明影响转染效率的因素，将有利于进一步提高脂质体的转染效率。随着分子生物学和生物化学的不断发展，阳离子脂质
14、体转染基因机制的研究将不断深入，转染过程中的影响因素也不断地得到阐明，从而为提高转染效率提供重要的理论指导。参考文献：1Tresset G. The multiple faces of self-assembled lipidic systems.PMC Biophysics. 2009;2(1):3.2Kumar M, Jinturkar K, Yadav MR, et al. Gemini amphiphiles: a novel class of nonviral gene delivery vectors. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2010;2
15、7(3):237-278.3 W A SUNGU L, HOEK STRA D. Cationiclipids, lipoplexes and intracellular delivery of genes J. J Control Release, 2006, 116 ( 2) : 255- 264.4MAB, ZHANG S, JIAN G H, et al Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery J . J Control Release, 2007, 1
16、23( 3) : 184- 194.5Shigeta K, Kawakami S, Higuchi Y, et al. Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte-selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells J . J Controlled R elease, 2007, 118 ( 2 ) :262-270.6MADEIRA C, LOURA LM , PRIETO M , et al. Liposome complexation e
