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1、根癌农杆菌介导遗传转化心得根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转变的研究进展纲要：根癌农杆菌介导的遗传转变系统因拥有操作简易， 转变效率高， 简单获取单拷贝随机插入的转变子， 并且转变子稳固等特色而成为最近几年来丝状真菌遗传转变的主要研究手段之一，也使该系统有可能成为丝状真菌基因组研究的有力工具。 本文就根癌农杆菌转变丝状真菌原理、过程、种类、影响转变效率的要素及其应用等方面进行了综述。重点词根癌农杆菌；丝状真菌；遗传转变丝状真菌（ filamentous fungi ) 是真菌中一个很大类群，往常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。 其在自然条件下常惹起食品、 工农业产品的霉变和植物的真菌
2、病害，在工业、农业、医药及基础生物学研究中拥有重要作用。丝状真菌中好多种拥有重要的经济价值， 还有一些是昆虫、 植物、动物和人类的重要致病菌，如绿僵菌 （ Metarhiziumanisopliae) 、稻瘟菌（Magnaporthe grisea) 和烟曲霉（Aspergillusfumigatus) 等。而构巢曲霉（Aspergillus nidulans) 和粗拙脉孢霉（Neurospora crassa)因为构造简单，往常被作为真核微生物的 “模式” 种用于基础研究 1。因为丝状真菌在经济上和科学中的重要性，多年来向来被宽泛地研究。最近几年来发展了好多转变的方法， 但并不是全部方法都合
3、用于丝状真菌。 过去丝状真菌的惯例 转变方法 有 PEG 介导的 原生质体 转变，限制酶 介导的插 入突变 （ Restrictionenzyme-mediated insertional， REMI) 等，可是这些转变技术或需要制备原生质体、或转化效率低阻挡了它们在研究丝状真菌功能基因中的应用。根癌农杆菌介导的转变系统（Agrobacteriumtumefaciensmediatedtransformation， ATMT)战胜了这些弊端为丝状真菌的遗传转变和功能基因研究供给了有力的工具，现已被宽泛地运用于丝状真菌的遗传操作当前已经实现了对泡盛曲霉（ Aspergilus awamori)
4、、粗拙脉孢菌（ Neurospora crassa ) 、尖孢镰刀菌（ Fusarium oxysporum) 和瓜类炭疽（ Colletotrichum lagenarium ) 等 60 多种真 2菌的遗传转变。1、根癌农杆菌介导遗传转变的丝状真菌的原理和种类根癌农杆菌是革兰氏阴性土壤杆菌自然状况下它可经过伤口侵入植物致使受伤部位产生瘿瘤，并将其T-DNA序列转入植物细胞并整合到植物染色体上 3利用这一原理获取第一批能表达外源基因的转基因植物。根癌农杆菌正被宽泛地应用到植物的遗传转变中。在大肠杆菌与酵母菌能够经过接合的方式将前者的质粒转移到后者 4和农杆菌转变植物等现象的启下， Bundo
5、ck 等人试试用根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转变，发现根癌农杆菌能够转变酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ) 5，显示了根癌农杆菌能够转变除植物之外的其余物种。很多科研工作者也纷繁投入到利用该方法对其余真菌的遗传转变的工作中，拓宽了根癌农杆菌的转变范围。与根癌农杆菌介导植物遗传转变相像，农杆菌转变真菌时，相同需要vir （ virulence)基因的活化，即T-DNA（ transferred DNA) 转移至真菌同植物相同是依靠于毒性系统的。Michieise 等利用一系列毒性蛋白基因缺失的农杆菌突变体转变Aspergillus awamori，以说明不一样毒性蛋白
6、在 T-DNA转移至 Aawamori 的作用。研究结果显示，任何一个调理蛋白（ VirA ，VirG) ，或许是转运通道蛋白 （ virB) ，或是 T 链复合物形成蛋白 （ VirD ，VirC ，VirE2)的失活都会严重的降低转变效率。这一结果表示，农杆菌介导Aawamori 的高效转变需要一个完好的T-DNA 转移体制。这些都证明农杆菌转变高等和低等真核生物的机理拥有必定的守旧性。但是， Michielse等的研究也显示，VirE3 ， VirH ，VirF 毒性蛋白，在农杆菌转变Aawamori 的过程中其实不是必要的。还有研究表示控制农杆菌向植物细胞附着的chvA，chvB及 e
7、xoC基因在酵母的转变中也并不是必不行少。所以，根癌农杆菌转变真菌的机理还需要由更多有关的试验研究来说明。2、丝状真菌 ATMT转变大概过程丝状真菌 ATMT遗传转变过程比较简单，不需要复杂的仪器设施，且基真相同，挨次为建立二元载体、活化根癌农杆菌、准备真菌分生孢子和共转变，大概以下：依据实验目的建立二元载体，挑取携有双元载体的根癌农杆菌单菌落到含有相应抗生素的基本培育（minimalmedium ，MM)中培育留宿； 采集菌体用引诱培育液（ inductionmedium， IM) 清洗并稀释至必定的浓度后待用或在含有乙酰丁香酮（AS， acetosyringone)的引诱培育液中培育后再使
8、用 ；取前述农杆菌液与等量新鲜的真菌受体混淆，并涂布于固体共培育基（co-cultivationmedium，CM)承载的滤膜上 （或以液体形式混淆振荡培育) ，恒温培育一段时间；洗脱（或汲取 ) 共培育物，涂布选择性平板，培育至菌落形成后挑取转变子，将抗性菌落转移至新鲜含有适合抗生素的培育基上培育，采集菌丝体 提取抗性菌落的基因组DNA，经过 Southern 杂交来判定阳性转变子和确立插入T-DNA 的拷贝数，以及经过TAIL-PCR（thermal asvmmetric interlaced PCR)技术来获取 T-DNA 的侧翼序列。3、根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转变的特色经过基因插
9、入失活获取能覆盖整个基因组的突变体库是功能基因组学研究的基础性工作，可是成立真菌突变体库的传统方法都存在弊端如转座子法的插入位点不完好随机，而且偏向于插入非编码位点；REMI 致使较高比率的非质粒插入突变体，并且易产生多拷贝插入，这给突变体剖析带来好多麻烦。有关于转座子和REMI技术，农杆菌介导的真菌转变具有以下四个特色：3.1 多种种类转变受体好多真菌在 DNA 转变时仍旧需要制备原生质体。不一样真菌原生质系统备的条件差别很大，所以常常遇到原生质系统备率或重生率低 5 等问题。 而 ATMT转变的受体资料能够是多种种类的，既能够用原生质体，也能够用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体 6。3.2 转
10、变效率高同传统的真菌转变方法，如PEG CaCI2 法对比， ATMT方法的转变效率有显然提升。研究表示农杆菌介导丝状真菌的转变效率一般在300 7200个转变子每 107 个细胞 比一般真菌转变方法高 100 1000 倍 6。3.3 随机插入单拷贝ATMT的非同源转变，大多半转变子为单拷贝的T-DNA 插入。转变子基因组中T-DNA插入比率高，且多为单拷贝插入。REMI 方法转变的突变体20 100都不是由 DNA插入引起的，而农杆菌转变的突变体有90以上都是由DNA插入惹起的7。3.4 转变子稳固农杆菌介导的丝状真菌遗传转变系统能够利用各样形式的受体所以当采纳拥有单核的分生孢子为转变受体
11、时能够获取后辈不分别的转变子， 防止了真菌菌丝多核所造成的转变子不稳固的难题。 而转座子法和 REMI等转变方法都需要采纳多核的菌丝为原料置备原生质体，产生不稳固的转变后辈。4、影响根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转变效率的要素转变效率高低是权衡一个转变系统利害的重要指标 研究表示转变条件对农杆菌介导的遗传转变效率有显然的影响。影响转变效率的要素包含农杆菌菌株的种类、真菌受体种类、转变细胞的浓度、已酰丁香酮的用量、共培育时间和温度等。农杆菌菌株对转变效率的影响能够转变丝状真菌的农杆菌有好多种，当前比较不一样菌株对转变效率影响的实验还很2少，所以不可以判断哪个是最有效的转变菌株 。可是能够必定菌株种
12、类对转变效率是有影响的，而一些菌株根本不可以用于特定真菌的转变。4.2 真菌受体对转变效率的影响选择适合的受体组织关于实现丝状真菌高效快捷的转变特别重要。大多半丝状真菌很容易培育产生大批的分生孢子，所以采纳孢子或刚萌生的孢子作为受体往常是真菌转变中最方便高效的选择 8能够直接以菌丝体组织为受体进。关于产孢子能力差甚至于不产孢的菌株，行转变操作。采纳不一样受体组织，转变效率常常会遇到影响。4.3 乙酰丁香酮对转变效率的影响Michielse等研究表示农杆菌介导的真菌转变系统和植物转变系统的原理相同，都需要一系列 Vir 蛋白的参加此中VirF 、 VirH 和 VirE3 是丝状真菌转变不行缺乏
13、9。乙酰丁香酮（ AS)在转变中的作用是引诱Vir 毒蛋白的产生。 研究表示 AS 是转变成功与否的决定性因素对 Beauveria bassiana、 Fusarium oxysporum 和 Trichode viride等真菌的转变条件研究表示在引诱过程中不加入AS 会致使转变效率的降低 10。而共培育过程中缺乏 AS11会致使无转变子的产生此外乙酰丁香酮在引诱和共转变过程中的浓度也影响转变效率。转变受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转变效率。较高的受体孢子浓度转变率相对较高。相同使用较高浓度的农杆菌也能够提升转变效率。可是对这两个因向来说其最高使用浓度都有必定的界线12当受体真菌的细胞浓度过高时则致使真菌的过度生长而不可以挑出转变子，使转变效率降低。13 相同原由，当农杆菌浓度过高时因为农杆菌过分生长惹起严重污染，也会致使转变率降落。4.5
