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1、生物电镜技术学习指导一、 基础知识1、世界上第一台透射电镜发明于1931年。2、人眼观察物体的能力是由视角、亮度、反差等视觉要素所决定的。3、正常人眼在明视距离250的分辨率是0.2。4、电子透镜可分为静电电子透镜和磁电子透镜。现代电镜中只有在电子枪中应用的静电电子透镜是由阳极、栅极和阴极组成。5、电磁透镜的像差有几何相差、像散、色差和衍射差。6、电子与固体样品发生作用时，可产生的各种信息有透射电子、二次电子、俄歇电子、X射线、 背散射电子、吸收电流。7、透射电镜的基本组成可分为电子光学部分、真空排气部分和电气部分三大部分。8、生物样品的反差主要是由物质的质量厚度决定的。9、判断电镜图像焦是否
2、精确常采用图像摇摆法和费涅尔条纹法。当放大倍数小于5万倍时用图像摇摆法，大于5万倍时用费涅尔条纹法。10、扫描电镜的特点是图像景深大、立体感强和样品的适应性强。11、扫描电镜主要是由电子光学系统、信号检测及显示系统、真空系统和电源系统组成。12、扫描电镜观察用显像管是长余辉的，而摄影管是短余辉的。13、常用的支持膜有Formvar 膜、火棉胶膜、帕罗丁膜和碳膜。14、微筛的制作方法有哈气法、甘油法和气压法。15、常用的固定方法有单固定法、双固定法、原位固定法和灌流固定法。16、常用的脱水剂有乙醇、丙酮等。17、常用的负染色方法有滴染法、漂浮法和喷雾法。18、扫描电镜生物样品干燥方法有自然干燥法
3、、真空干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法。19、覆盖于载网之上的一层电子透明的薄膜称为支持膜。20、常用的固定剂有醛类、四氧化锇和高锰酸钾。21、扫描电镜生物样品制备的主要步骤有清洗与固定、脱水与干燥和增强导电性。22、用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体物质称为中间剂。二、 名词解释1、视角：由物体两端通过眼的光学中心的联线所成的角。2、极靴：在包壳透镜空心处加装的一对导磁率极高的铁钴金制件。3、像差：指实际光学系统和理想光学系统成像的差别。4、场深：电镜的场深是指透镜物方轴上的一段距离，在此距离内，当调节物镜电流改变焦点时，图像始终清晰。5、焦深：在透镜的像方存在着的一个与场深等效的轴间
4、距离，在这段距离上，假定物的位置保持不变，只移动像，像一直是清晰的。6、二次电子：样品原子的核外电子受入射电子激发后，逸出样品表面时的电子。7、倾斜角效应：当入射电子束强度一定时，二次电子信号的强度随样品倾斜角增大而增加。8、边缘效应：在样品边缘和尖端部位二次电子极易脱离样品，产生较多的二次电子，图像异常明亮。9、像素：指构成扫描电镜图像的许多明暗相间的小点，即构成图像的基本单元。10、支持膜：指覆盖于载网上的一层电子透明的薄膜。11、载网：在透射电镜技术中使用的一种圆片状极细的网状材料。12、取材：从动植物有机体上或从培养物中取得所需材料的操作。13、固定：用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过
5、程。14、脱水：指用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离态的水。15、负染色技术：又称为阴性反差染色技术，是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外围的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。16、有效放大：人眼的分辨率与显微镜的分辨率的比值。17、电子透镜：指轴旋转对称的电场或磁场，对带电粒子有聚焦作用。18、质量厚度：即样品的质量与厚度的乘积。19、电子探针：指扫描电镜中用于在样品表面做光栅状扫描的极细的电子束。三、问答题1、生物样品取材的基本原则和要求。生物材料在离开机体或正常的生长环境之后，其组织结构往往在自溶酶的作用下，迅速发生各种死后变化，为尽可能保持生物材料生活状态
6、时的结构，取材操作应遵循以下原则和要求：准确：应根据研究目的与要求，准确定位而后取材，取得的材料要具有代表性。迅速：取材速度要快，动物材料体后须在1分钟或更短的时间内立即投入固定液中，以减少自溶作用的影响。体积小：固定剂的适能力较弱，（O3O4为0.25，或戊二醛为0.5）为保证固定剂能浸入到材料的各个部位，一般要求样品体积的大小不超过13或截面为12的长条。低温：生物材料离体后，组织细胞中的各种酶尤其是溶酶体中的水解酶将释放到组织中，使构成组织结构的主要成分如蛋白质、核酸等迅速降解，造成自溶。为降低酶的活性，要求在0-4的低温条件取材，所用的容器及器械等应预先冷却。防损伤：取材器械要锋利，动
7、作要轻巧，防止牵拉、挤压，造成组织细胞内部结构的损伤破坏。2、透射电镜制样中的双固定法及其原理。双固定法即戊二醛锇酸双固定法，先用戊二醛前固定，再用锇酸后固定。戊二醛毒性不大，有两个醛基，对细胞的结构有很高的亲和力，能稳定糖元，保存核酸、核蛋白，尤其对微管、内质网等细胞膜系统和细胞质有较好的固定作用，且长时间固定的材料不变脆不变黑，宜于野外作业或长时间保存材料。戊二醛单体分子小，固定速度快，可突破13块的界限。其缺点是不能保存脂肪，无电子染色作用。锇酸毒性大，易挥发，是一种强的氧化剂，与氮原子有极大的亲和力，能与各种氨基酸、肽及蛋白质反应，在蛋白质分子之间形成交联，固定蛋白质物质。锇酸能与脂肪
8、中的不饱和脂肪酸链结合形成脂肪-锇的化合物，通过形成锇酸二酯键，在不饱和脂肪酸分子间形成的交联，固定脂肪物质。锇酸还能固定脂蛋白、核蛋白，但不能固定核酸和糖类。锇酸对生物样品据具有较强的电子染色作用，能产生一定的电子反差。由此可见，戊二醛和锇酸各有优缺点，二者优势互补，配合使用，会收到良好的固定效果。3、扫描电镜生物样品制备的原因。扫描电镜本身的构造、性能和成像原理要求被观察的样品必须具备下述条件：样品必须干燥，不含水分或其它可挥发性物质；在一定程度上能耐受电子束的轰击，具有一定的机械强度；被激发时能产生二次电子；具有一定的导电性能。生物样品含水分较多，质地柔软，干燥脱水之后极易干瘪、收缩、变
9、形；一些幼嫩材料的形态结构极易受渗透压、PH值等环境变化的影响；机械强度低，不能耐受电子的轰击；多数生物组织是由C、H、O、N、P等原子序数较低的元素组成，不易被激发产生二次电子。生物样品中所含的游离态水分和可挥发性物质，在真空条件下极易挥发，产生的气体会破坏镜筒的真空度，影响电子路径和电子波长，降低图像清晰度和分辨率，严重时不能观察，同时，样品干燥变形，失去观察价值，因此对含游离态水分的生物样品必须进行脱水干燥处理。扫描电镜主要观察二次电子图像，生物样品不易激发出大量的二次电子，必须对样品进行处理（如真空喷镀、导电染色、离子溅射等），以提高二次电子的产量。生物样品本身导电率很小，尤其是样品与
10、样品台之间的电阻较大时，一次电子极易在样品表面积累，造成较高的负电位，影响后续一次电子的激发能力，并产生放电现象，因此必须对生物样品进行导电处理（如金属镀膜或用导电胶粘样等）。生物样品经固定和镀膜处理之后可提高其机械强度和抗电子束轰击的能力，有利于高分辨、高培率和长时间观察。生物样品必须经过制样处理，以满足扫描观察的要求。4、以液体二氧化碳做干燥剂为例，说明临界点干燥的原理。将经两次置换的样品放入一个耐高压并可密闭的容器中，充入一定量的液体二氧化碳之后，密闭容器并对容器加热。当容器二氧化碳达到31.1和72.8大气压时，气、液态二氧化碳密度相等，相界消失（该状态称作临界状态）。此时液态二氧化碳
11、的分子内聚力为零。液体表面张力系数为零，即不存在表面张力。保持临界状态而继续对容器加热，并以一定速度排放二氧化碳气体，直到放尽为止，使样品在无表面的张力的临界状态下得以干燥。5、生物样品的特点是什么？ 生物样品含游离态水分多，质地柔软，脱水干燥后易干瘪、浓缩、变形；一些幼嫩材料的形态，结构极易受渗透压、PH值等环境变化的影响；机械强度低，不能耐受电子束的轰击；多数生物组织主要是由碳、氢、氧、氮、磷、钾等原子序数较低的元素组成，不易被激发产生二次电子。6、电镜技术在农业上的应用。电镜技术在农业上的应用起步较晚，但得到了飞速发展。电镜技术广泛地应用于疾病诊断和防治、植物保护、良种繁育、品种鉴定和分
12、类、形状鉴别、成分分析、土壤改良等多学科的生产、科研和教学工作中，已取得了优异的成果。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所利用透射、扫描、冷冻蚀刻学技术确定了马传贫病毒的三维结构为典型球形，并弄清了其结构，建立了马传贫病毒的结构模型，填补了该病毒的形态空白。许多单位观察了花粉的形态结构，并依据其形态结构特点开展了品种分类与鉴定，育种等工作；研究了高粱、水稻茎杆的微细结构与倒伏的相关性，为育种工作提供了性状指标；利用扫描电镜观察分析了施用土壤改良剂、各种肥料之后，土壤细微结构的变化，探索出一条研究土壤改良的新方法，开展了施肥、施药、施加各种理化因素对害虫及植物生长发育、形态结构、细胞成分的影响及其作用机理的研究，这些工作为防治病虫害，提高产量和品质、培育良种开辟了新的途径。1
