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1、第十章 化学发光免疫技术第一节概述发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。这种方法兼有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性。发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 光照发光、生物发光、化学发光。 一、化学发光化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发
2、光。化学发光与荧光的区别是形成激发态分子韵激发能不同。荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光；而化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光。因此，化学发光反应的首要条件是反应必须提供足够的化学能。通常只有那些反应速度相当快的放能反应，才能在可见光范围内观察到化学发光现象，而氧化-还原反应所提供的能量介于其中，因此大多数化学发光反应为氧化-还原反应。第二个条件是吸收了化学能而处于激发态的分子或原子，必须能释放出光子或者能将能量转移到另一个物质的分子上并使其激发，当这种激发分子回到基态时释放出光子。一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，
3、则这种反应过程称为直接化学发光。二、化学发光效率化学发光反应的发光效率又称化学发光反应量子产率。化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。因此，可设计出不同的反应模式。 第二节化学发光剂和标记技术一、化学发光剂在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。能作为化学发光剂的有机化合物必须具备下列条件：发光的量子产率高；它的物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合
4、物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。 （一）直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用。 包括吖啶酯和三联吡啶钌。 （二）酶促反应发光剂 利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。 目前化学发光酶免疫分析中常用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶。 辣根过氧化物酶催化的发光剂为鲁米诺及其衍生物。 碱性磷酸酶催化的发光底物为AMPPD。 二、发光剂的标记技术发光剂的标记是通过化学反应将发光剂连接到抗体或抗原上。 标记反应分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。 （一）常用标记方法1.碳二亚胺缩合法 2.过碘酸钠氧化法 3.重氮盐偶联法 4.
5、N-羟基琥珀酰亚胺活化法 （二）影响标记的因素 1.发光剂的选择 2.被标记蛋白质的性质 3.标记方法的选择 4.原料比 5.标记率 6.温度 7.纯化与保存 第三节化学发光免疫分析的类型一、直接化学发光免疫分析直接化学发光免疫分析是用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体（抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和pH纠正液（NaOH）使呈碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光，由集光器和光电倍增管接收，记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测
6、抗原的含量。二、化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗体（或抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相包被抗体一待测抗原一酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光。由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。三、电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（ECLIA）与一般化学发光分析不同，是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），以三丙胺（TPA）为电子供体，在电场中因电子转移
7、而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体（抗原），用三联吡啶钌标记抗体（抗原），在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，同时引入TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光信号由安装在流动室上方的光信号检测器检测，光的强度与待测抗原的浓度成正比。四、临床应用由于化学发光免疫测定技术无放射性污染，同时能达到放射免疫测定的灵敏度，而且还具有快速、准确、特异、可自动化等特点，因此已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、药物浓度及其他微量生物活性物质的测定。
