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1、绪论1.1前言A1-40是阿尔茨海默病的主要标志物之一，且A单体可以自组装成高度有序的结构，包括二聚体、三聚体、四聚体，或者更大的结构，直至形成纤维。研究表明，A寡聚体具有更强的神经毒性，二聚体和三聚体会破坏神经纤维的弹性，而三聚体和四聚体的毒性是A纤维的二倍。总之，研究表明A早期积聚体可能是疾病诊断的依据之一1-6。因此能够及时、简便、有效的检测出A的这种异常的现象，则对于预防和治疗AD既有重要的理论意义又有实际意义。为了检测A的寡聚体，已经发展了抗体和单链抗体技术7-8，已报道这些抗体和特征分子形成特异性识别作用9。荧光分析法灵敏度高，使用方法简便，而且样品处理简单，具有在溶液中可无损、实
2、时连续检测等优点，因此得到广泛应用16-21。本文基于A抗体的研究基础，结合荧光技术，以A的DNA适配体为识别基团，结合荧光分析方法特点，制备荧光探针， 识别A早期积聚体。而探针T-SO508序列(5to3)为GCCTGTGGTGTTGGGGCG GGTGCG。本文针对探针T-SO508对A作用及检测进行实验。我们的实验证明，所制备的荧光探针对A1-40具有一定的识别作用，但是由于用于检测的A1-40没有以分子量将其区分，所以识别作用不是特别稳定，下一步准备看能否将A1-40分开，特征检测二聚体和三聚体。2 实验部分2.1 试剂和药品T-SO508（生物工程上海股份有限公司，1 mg，AR）修
3、饰5JOE,3TAMRA ，JOE：2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素，是荧光素衍生物的一种，6-JOE更被广泛使用。JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。6-JOE也适合于Argon-ion Laser激发光源，Abs/Em=520/548（pH=9.0）。常用于DNA自动测序，标记d/ddATP，也经常被用于进行电泳检测与PCR产物定量。TAMRA是用于标记蛋白的，全名为羧基四甲基罗丹明，是一种罗丹明类荧光素衍生物，其中6-TAMRA适用于Argon-ion Laser激发光源，常用于荧光标记试剂盒中，且Abs/Em=547/573nm（Ph=8.0）。探针浓度的配置：
4、加入500 L（TE缓冲溶液，PH=8.0）浓度为9 M，作为工作液1；TE缓冲溶液的配制：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 ml溶解，滴加浓Hcl约2.1 ml，调制PH=8.0，定容50 ml成1 M Tris-Hcl；称取9.306 g EDTA-Na22H2O，加超纯水35ml，剧烈搅拌，用约1 g NaOH颗粒调至PH=8.0定容至50 ml成0.5 MEDTA；1M Tris-Hcl 1ml,0.2 ml的0.5 M EDTA混合并加超纯水定容至100 ml。三种不同纯度的A1-40（上海强耀生物科技有限公司， 1.0 mg，AR），分别为A1-40纯度90%，A1-40纯
5、度95.65%，A1-40蛋白纯度98%，,用类似的方法将其配制浓度并作为工作液2：若加入溶剂二甲基亚砜0.5 mL则得到462 M 的A1-40；若加入溶剂二甲基亚砜1 mL则得到231 M的 A1-40。2.2 仪器设备Agilent Technologies Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer（安捷伦科技有限公司），用于荧光光谱、荧光强度的测定；荧光比色皿，移液枪，5 L的移液针，1 L的移液针，用于液体的移取，恒温水浴锅，试管加热器等。2.3 实验操作方法（1）实验分类将不同含量的A分为三组，第1组为A纯度为90%，向其加入1 mL二
6、甲基亚砜配置成浓度为231 M作为工作液2，T-SO 508探针中加入500 L TE(pH=8)配置成浓度为9 M作为工作液1。荧光测定仪在使用前预热15 min，比色皿要用TE缓冲溶液润洗，操作期间要保持所用仪器的清洁。每次加入试剂之前要用擦镜纸擦拭移液枪、微量进样器等，并多次更换移液头。第2组为A纯度为95.65%加入0.5mL二甲基亚砜配置成浓度为462 M的A作为工作液2，T-SO 508探针仍使用第1组中配置好的浓度。仪器及实际操作同上，但唯一不同的是本次实验要控制温度为37，打开白色暗箱使其停留在stand by 状态，同时打开恒温水浴锅，此时要注意检查循环水是否正常流通，待温度
7、达到37时才可以开始扫描。（水浴锅上显示的温度不准，以界面上温度控制系统显示的温度为准），每次加入试剂后待温度稳定后再扫描。第3组为A纯度为98%，加入0.5 mL二甲基亚砜配置成浓度为462 M的A作为工作液2；T-SO 508仍用第1组配置好的浓度；仪器与试剂操作同第一组。此次实验同样控制温度，但不用恒温水浴锅，采用试管加热器。首先将试管加热器设置为37，之后在每次加入工作液后将比色皿放入试管加热器中大约加热5 min即可达到37，取出并快速放入荧光检测仪中进行扫描。（2）荧光探针的测定荧光光谱的测定，取2.0 ml TE缓冲溶液置于已洗涤干净并用其溶液润洗过的比色皿中，作为参比，设定激发
8、波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线，荧光激发狭缝宽度为10 nm，发射狭缝宽度为5 nm。再向比色皿中加入5 L工作液1，设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。标准加入法不断的向比色皿中加入工作液1直到它的强度不在随浓度的变化而变化。此时的探针达到最大强度，记下此时的荧光强度作为F
9、0，并且每次扫描都记录相应的荧光强度。（3）检测A1-40当探针T-SO508的荧光强度最强时，向其比色皿中逐次加入A1-40即工作液2，充分搅拌均匀后，设定激发波长526 nm，响应时间为自动，中速扫描，测定范围为527-650 nm，以扫描出发射线；再设定发射波长为553nm，响应时间自动，中速扫描，测量范围为450-550 nm，以扫描出激发线，荧光激发狭缝宽度为10 nm，发射的狭缝宽度为5 nm。此外，再以激发波长为553 nm，测量范围为554-650 nm扫描出发射线。记录每次扫描时的波长与其对应的荧光强度，并以F1、F2、F3等等标注。3 结果与讨论3.1 T-SO508的荧光
10、光谱性质在2 mLTE缓冲溶液中加入浓度为9 M探针T-SO508，设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。随着探针的不断加入荧光强度不断增强直到加到23 L，此时荧光信号为71，探针浓度为0.207 M。每次扫描记录荧光强度，不同浓度下的荧光强度如下图所示：图 1 不同浓度荧光探针的荧光强度随探针的浓度的变化曲线，其中探针T-SO508的浓度分别为(0,22.5,27 ,45,54,58.5,63,67.5,72,76.5,81)10
11、-9 mol/L由图可见，随着荧光探针的加入，荧光强度不断增加，其浓度和荧光强度的线性方程为y=3.11x+6.51，相关系数为0.998，样本容量11。3.2 T-SO508对A1-40的检测作用用A1-40纯度90%配置浓度为231 M工作液2，如图2所示；在浓度为0.207 M的探针中开始加入A，共加入23 L。设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。图中右下侧为设定激发波长553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为553
12、-650 nm，扫描出发射线，也就是F1F2F3等等这些荧光强度。图2 A1-40（上海强耀生物科技有限公司，1.0mg,纯度90%）加入的A浓度分别为（0,5.78,11.55,17.33,18.48,19.64,20.71,21.95,23.1,24.26,25.41,26.57）10-7 mol/L由图可见，随着A1-40的加入，荧光强度不断降低，以未加入A1-40时荧光探针的的荧光强度为F0，加入A1-40后的荧光强度为F，以F/F0对A1-40的浓度作图，由插图可见，随着蛋白浓度的增加，发射强度呈下降趋势，F/F0对A1-40的浓度的线性方程为y=-0.0061x+1.2226，相关
13、系数为0.9097，样本容量9。3.3 温度对荧光强度的影响（1）用A1-40纯度95.65%配置浓度为462 M作工作液2，如图3所示；采用温控系统控制温度在37 （实验室温控系统出错，可能比实际温度高）。设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。探针T-SO508直到加到26 L开始加入蛋白共加入104 L，每次扫面记录荧光强度。图3 探针强度随A1-40浓度的变化（A1-40，上海强耀生物科技有限公司,1 mg，纯度95.65%）A
14、1-40的浓度1-10分别（1.16,2.31,3.47,4.62,5.78,6.01,6.24,6.7,7.86,10.16,12.48,14.79,19.40,21.71,24.02)mol/L由图可见，随着A1-40的加入，荧光强度不断增强，以未加入A1-40时荧光探针的的荧光强度为F0，加入A1-40后的荧光强度为F，以F/F0对A1-40的浓度作图，由插图可见，随着蛋白浓度的增加，发射强度呈下降趋势，F/F0对A1-40的浓度的线性方程为y=6.319x+0.9898，相关系数为0.9868，样本容量11。（2）A1-40纯度98 %配置浓度为462 M作工作液2，如图4所示；控制温
15、度37 （在试管加热器中设置37 ，每次加入溶液后加热5 min）；设定激发波长526 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为527-650 nm，扫描出发射线；再设定发射波长为553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测量范围为450-550 nm，扫描出激发线。探针加入45 L时加入A，共加入105 L，右侧图为设定激发波长553 nm，中速扫描，响应时间为自动，测定范围为553-650 nm，扫描出发射线。图4 左图为探针荧光强度，浓度分别（22.5,45,67.5,90,112.5,135,139.5,148.5,157.5,180,202.5）10-9 mol/L；右上方为探针荧光
16、强度随体积变化曲线，成上升趋势。右图为加入A以553nm为激发波的荧光强度，而加入的A浓度分别为（2.31, 4.62, 6.93, 8.09, 10.40, 12.71, 15.02, 17.33, 21.95, 24.26）mol/L；右上方为A荧光强度随体积的变化曲线，成上升趋势。由图4-1可见，荧光强度随着荧光探针的增加而增加，由图4-2可见，随着A1-40的浓度的增加，发射强度呈上升趋势。随着A1-40的加入，荧光强度不断增强，以未加入A1-40时荧光探针的的荧光强度为F0，加入A1-40后的荧光强度为F，F/F0对A1-40的浓度的线性方程为y=（3.2710-4）x+1.01，相关
