《高效液相色谱仪HPLC的使用及发展.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱仪HPLC的使用及发展.doc（15页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 药品生产质量管理工程学院：化学科学与工程学院 专业：无机化学 姓名：袁晓红 学号：12014001074高效液相色谱仪（HPLC）的验收、使用及维护摘要：高效液相色谱仪在许多领域应用日益广泛，又因为它主要靠进口，价格比较昂贵，所以它的使用和维护显得十分重要。本文阐述了从购买到安装、检测高效液相色谱仪的操作步骤及高效液相色谱仪的系统组成、各部件的功能和工作原理以及在使用过程中应注意的问题，注意维护从而达到节约仪器耗材、延长仪器使用寿命的目的。关键词：高效液相色谱仪；验收；使用；维护高效液相色谱仪它是在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论和技术而发展起来的。在高效液相色谱中，流动相与组分之间
2、有一定的亲和力，分离过程的实现是组分、流动相和固定相三者间相互作用的结果，分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关，一般情况下，高效液相色谱仪的分析可在室温下进行，由于采用颗粒极细的固定相，柱内压降很大，加上流动相黏度高，因此必须采用高入口压，以此来维持一定的流动相线速。高效液相色谱仪对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的物质特别有利，它在医药、生化等方面具有非常重要的作用。1.高效液相色谱仪的结构和原理高效液相色谱仪主要贮液器、脱气器、高压泵、进样器、色谱柱和检测器等组成。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论。在技术上，流动相改为高压输送：色谱柱是以特殊
3、的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱；同时连接有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续精确地检测。其工作原理如下：首先储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在流动相和固定相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附一解吸的分配过程，各组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而，按先后不同顺序从固定相中流出，通过检测器时，样品浓度被转换成信号传送到记录仪，数据通过以谱图等形式记录下来。2.高效液相色谱仪的验收 仪器验收是一项很细致的工作。仪器验收的目的是检查外商提供的商品是否达到了它的性能指
4、标。一台高效液相色谱仪到货后，首先要组织一个精悍的验收小组，由液相色谱专家、应用技术人员、电气技术人员和器材部门的代表组成。应准备专用的记录本、详细记载验收过程中的原始记录。整过程分数量验收、外观检查和质量验收三步。 即首先俭查货物装箱单上所开列的物件与原订货合同是否相符、核对无误后对主机和各零部件进行外观检查，仪器经过长途运输和装卸、难免有叩碰、如果防震、耐压的包装完善的话、是可以完好无损地到达用户手中的。若发现包装破损就要注意仪器有否受损，特别对那些精密光学部件和光源有否发生位移和破碎。仪器如无缺损、外观完好、则在仔细阅读使用说明书后即可开始质量(或性能)验收的工作。 高效液相色谱仪的主要
5、部件有高压泵、进样阀、色谱柱、检测器、记录器和梯度装置等。先进行单机检查、然后再联机测试单机检查是指脱开其他连接部件、单独对某一组件进行检查。然后对整个系统联机测试。2.1高压输液泵 主要检查其压力和流量能否达到规定的指标。例如，指标规定该高压泵可达最高压力500公斤/厘米2“则在泵出口处接一堵头，观察泵压是否可达500公斤/厘米2“，系统的所有接头处有否渗漏象，泵密封垫圈是否可靠地工作。目前.高压泵的流量范围一般为0.05 -9.9毫升/ 分，须检查流量精密度和重复性。流量精密度是指在设定流量条件下与实测流量是否相符，方法是用精密量筒和停表测定单位时间的流量，一般，在最低或最高流量条件下客易
6、偏离原设定流量。所谓重复性是指在不同情况下(如空载和不同柱压降)流量的变动。这里要注意的是大多数泵的压力、流量指标分两档，即流量5毫升/分以下最高压力为500公斤/厘米2，0.05 一9.9毫升/分的最高压力为250公斤/厘米2，不能要求在高流量条件下达到最高压力。2.2检测器2.22紫外吸收检测器 包括单波长和可变波长两类。需要检查以下几项，噪音和漂移 将灵敏度放在最高档程，分别在静态和动态条件下( 即没有或有流动相通过检测池) 测定基线的噪音和漂移（图1），并同指标比较。稳定性 检测器连续工作12小时或24小时，观察基线噪音和漂移的情况。灵敏度自检(以LD C公司1203单波长紫外检测器为
7、例) 将档程(RANGE) 放在0.512位置，选择开并(ZERO/CHE CK)，放在CH-ECK，记录器应偏转满标的50 %。换句话说，从电气线路给出0.268 土0.01AU的偏转值，看记录器指示是否相应偏转满标的50 %。动态线性范围随着样品量的改变，检测器有一个线性响应的范围（图2）有的是3个数量级，有的是4个数量级。波长精度测定 各种可变波长检测器有不同的检查方法。例如日立200-10型分光检测器利用氖灯在656.1nm 光谱线检测。从658nm 开始慢慢向短长扫描，记录仪应在656.1土0.4nm范围获得最大读数，如能重复几次即可视为达到了指标要求。2.23杀差折光检测器 有两种
8、。一种是反射式示差折光检测器(例如LDC公司生产的)，有两个棱镜(折光指数为1.31-1.45和1.40-1.55)，根据所用溶剂和被测样品的折光指数的范围来选择。使用前先要调整跟踪(Track )，否则基线无法归零，并有显著的漂移和噪音。跟踪调整方法可参阅说明书。基线噪音和漂移 示差折光检测器易受温度的影响，漂移可能会较大，可按指标要求检查。跨导 (Spa n) 调整用来准确刻度示差折光单位(RIU)，以便在记录仪上可直接读出RIU。方法如下：溶解13.33克干燥过的蔗糖于10 毫升蒸馏水中。再取出5毫升稀释至1升。该溶液应为10-4IRU。将该溶液注入样品池。测量档程放在16位置。记录仪应
9、偏移至满标的62.5%，如不够或超过均可调SPan电位器至该偏转位置。 另一种是偏转型示差折光检测器，范围较宽，可测折光指数1-1.75，例如日本昭和电工生产的Shodex RI，SE-51，其跨导调整稍有不同，方法如下，溶解220 毫克蔗糖于10 毫升脱气蒸馏水中，该溶液的折光指数同蒸馏水折光指数之差应为32 10-5RI U，将该溶液注入样品池，参比池保持蒸馏水，测量挡程放在32位置，记录笔应偏移满标的100%，如不够，可调机，体内的SPa n电位器。 动态线性范围和最小检测量并无固定指标可视需要测定。2.24荧光检测器 目前多数是光栅自动扫描荧光检测器，其激发波长和发射波长范围为220-
10、780nm， 检查光栅准确度如果氨灯作光源，样品池盛满馏水，激发波长(Excitaton Wavlength) 放在O位置，发射波长(Emission Wavelength ) 在467nm 慢慢来回转动发射波长度盘，并注意指示表的读数在最大的位置，此时发射波长应在467 土5nm 为合适。 反过来，发射波长放在O位置，激发波长在467nm 附近慢慢来回转动，指示表在最大读数位置处，激发波长应在467士5nm。检查已知样品的荧光光谱 用标准样品蒽，配置0.01微/毫升的乙醇溶液，激发波长放在250nm，发射波长扫描图3。定量分析配置不同浓度的硫酸奎宁0.1 N硫酸溶液，在激发波长365nm 和
11、发射波长46onm 条件下，作定量工作曲线（图4) 检查检测器的线性响应。还可用蒽或丹酰化氨基酸测定最小检测。2.3进样阀 进口液相色谱仪都采用进样阀进样，其工作压力多数在150公斤/厘米2，所以，若较长时间工作在150 公斤/厘米2以上极易损坏进样阀转子造成漏液。对进样阀主要检查两项指标。2.31定量准确性 进样阀都有固定体积的定量管(Loop)一般是10 微升和20 微升，可用微量注射器精确测量定量管的体积。一次进样的绝对量是通过样品液的浓度乘上定量管体积得到的。2.32重复性 连续几次进样，分别测得检测器的响应值( 以峰高或峰面积表示)，可算出均方偏差和变异系数。2.4色谱柱 色谱柱是液
12、相色谱仪的重要组件，在运输过程中由于振动或柱内溶剂挥发导致柱效下降、柱分离效能变差，因此，需要检查几个指标。2.41柱效 选择一个纯净的已知样品和合适的流动相，得到样品的保留体积和半峰宽( 也可取峰底宽)，如每根柱子长度为25 厘米，则理论塔板高度H=L/N 所以 H=250/7369毫米=0.034毫米 各种柱子测柱效使用的已知样品和流动相各不一样，如C1 8反相柱可用作萘已知样品75 %甲醇25%水为流动相。2.42峰不对称性 由峰尖作垂线与底线相交，在峰高10%处截取A和B，然后计算峰对称因子B/A，一般以0.8-1.2为宜。2.5记录仪2.51灵敏度有1.2.5.10.20.50.l0
13、0.500.l000毫伏各挡，分别代表满标毫伏数。可用标准电子电位差计分别向记录仪输入上述各毫伏数，视记录笔是否满标偏移。2.52准确度 如指标规定为满标的0.3%，则向记录仪输入某一毫伏数几次，观察满标响应值的偏差和重复性。2.53记录纸速度 可设定某一记录纸速，如5毫米/分，在一定时间内量取走纸长度，与设定纸速比较。还可测定不同时间内记录纸速是否均衡。2.6梯度洗脱装置 一般，由梯度程序装置控制（图6），可作各种形式的梯度洗脱曲线。但由于混合室以及连接管道等死体积的存在，实际的梯度曲线(即流动相组成的变化)总要比理想的滞后一段时间（图7），故应尽量减小死体积和提高溶剂混合的效率。3.高效液
14、相色谱仪的实验室操作流程3.1开机步骤（1） 打开计算机后自动弹开菜单通信成功。（2） 打开色谱仪开关，进入在线工作站。（3） 预热30 min即可（4） 设置泵（5） 排气泡（6） 编辑检测方法（7） 参数设定（8） 基线调节（9） 样品信息（10） 开始进样（11） 停止采样（12） 峰优化（13） 打印报告3.2关机步骤 将手动进样器扳手扳上去，拔出进样器(自动进样器除外)；停止检器和泵，退出色谱工作站；关闭液相色谱仪电源，关闭计算机。4.高效液相色谱柱的正确使用4.1加装保护柱 保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪
15、在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2m 等不同孔径的滤器，但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然，因此，加装保护柱是必要的，特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱必不可少的措施。保护柱填料应与分析柱一致，粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品，经过一定次数的样品分析（50 -100次）后，出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时，应考虑更换保护柱。4.2过滤流动相和样品 流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成，原则上，所有经过色谱柱的流动相均应过滤，但在实际操作上应视具体情况而有所区别：当有机溶剂用色谱纯级，水用石英亚沸水或其它超纯水时，在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时，过滤并无更多实际意义。当流动相中含有缓冲盐时，则过滤是必要的，如前所述，当缓冲溶液放置一段时间（视环境温度不同而异，夏季一般不超过48h ，冬季一般不超过一周）后，在使用前还应重新过滤。所配制的样
