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1、块根块茎类作物内生固氮菌分离鉴定、系统发育与促生特性李艳星1,2，郭平毅1,孙建光2【摘要】摘要：【目的】分离鉴定块根块茎类作物内生固氮菌，研究块根块茎 类作物内生固氮菌的系统发育，分析测定块根块茎类作物内生固氮菌的促生特 性，探讨块根块茎类作物内生固氮菌的种群特点及其随寄主植物的分布特征。【方法】表面消毒块根块茎样品后采用低氮培养法分离内生细菌；通过对菌株 nifH的PCR扩增、测序确认分离细菌是固氮菌；通过16S rRNA基因测序、 比对初步鉴定菌株，分析菌株的系统发育；通过测定菌株产生ACC脱氨酶、植 物激素IAA，拮抗病原真菌研究菌株的促生特性。【结果】从胡萝卜、白萝卜、 马铃薯、紫甘
2、蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等14个块根块茎类 作物的块根、块茎中共分离到内生固氮菌219株。基于16S rRNA序列，这些 菌株在系统发育上分别属于Acinetobacter、Arthrobacter、Bacillus、 Brevibacillus、Brevibacterium、Chryseobacterium、Citrobacter、Delftia、 Domibacillus、Enterobacter、Fictibacillus、Flavimonas、Flavobacterium、 Microbacterium、Micrococcus、Paenibacillus、Pantoea、
3、Pseudomonas、 Rahnella、 Rhizobium、 Sphingobacterium、 Staphylococcus、 Stenotrophomonas、Variovorax，共计24属79种，显示了块根块茎内生固 氮菌丰富的种群多样性。鉴定结果显示，219株新分离菌株中有77株系统发 育地位属于Bacillus属的23个种，29株属于Pseudomonas属的10个种， 二者合计为33种106株，分别占系统发育种数和新分离菌株数的41.77%和48.40%,说明Bacillus和Pseudomonas属是新分离块根块茎类作物内生固 氮菌的优势种群。从219株新分离菌株中选取了
4、 79株代表菌株进行促生特性 研究，结果显示8.86%菌株检测到了 ACC脱氨酶活性（0.02613.76 pmola-T酮酸mg-1 蛋白h-1 ）, 64.56%菌株检测到了产 IAA（ 0.3428.99 pg-mL-1 ）, 6.33%13.92%菌株具有拮抗病原真菌能力（抑菌率 41% 63% ）。【结论】在正常生长的块根块茎类作物的块根块茎内栖息着大量内生固 氮菌；块根块茎类作物内生固氮菌在科学分类地位上分布广泛，达到24属79 种，显示出巨大的生物多样性；Bacillus和Pseudomonas是块根块茎类作物 内生固氮菌优势种群；大约10%60%的块根块茎类作物内生固氮菌显示出
5、产 生ACC脱氨酶、产生植物激素IAA、拮抗病原真菌等促进植物生长特性，这可 能是内生固氮菌有益于植物生长的内在原因。【期刊名称】中国农业科学 【年（卷），期】2017（050）001 【总页数】19 【关键词】块根块茎；内生固氮菌；系统发育；促生特性0引言【研究意义】胡萝卜、白萝卜、紫甘蓝、马铃薯、山药、莲藕、芋头、红薯、 生姜、甜菜等都是常见食才（甜菜是生产蔗糖原料），作为蔬菜、杂粮或调味品， 在人们的日常生活中起着不可或缺的重要作用。从植物学的角度，它们有一个 共同特征，都是块根块茎类作物（紫甘蓝为球茎），而且块根块茎正是人们取食 的部分。研究块根块茎类作物内生固氮菌对于加强人们对该类作
6、物的了解，获 得固氮菌资源，提高栽培技术，生产安全优质产品具有重要意义。【前人研究进 展】植物内生菌（endophytic bacteria ）指从经过表面消毒的植物组织器官或 植物体内分离出来的对植物本身有益无害的细菌1。现在这个概念有了一些扩 大，认为植物内生菌泛指生活史或某个生命阶段生活在健康植物体内，不引起 宿主植物外在病症的细菌、真菌或放线菌2，但不包括在植物体内定殖，引起 寄生植物病害的致病菌，也不包括菌根真菌3。植物内生固氮菌(endophytic diazotrophs)是植物内生菌中的一个主要类群，它们不仅具有 固氮作用，还有促进植物生长，提高植物抗病、抗逆等多种功能4。目前
7、，人 们在水稻5、玉米6、小麦7、甘蔗8等作物上都发现了内生固氮菌，对于 马铃薯内生固氮菌的研究也有报道9-10，但对于其他块根块茎类作物的内生 固氮菌了解尚少。【本研究切入点】通过农田采集和市场采购两种方式收集块根 块茎类作物的块根块茎样品，批量分离、鉴定内生固氮菌，研究块根块茎类作 物内生固氮菌的系统发育、促生特性，并探讨块根块茎类作物内生固氮菌的种 群特点及其随寄主植物的分布特征。【拟解决的关键问题】明确块根块茎类作物 内生固氮菌的系统发育、种群特点、分布特征、促生特性。1材料与方法试验于20142015年在中国农业科学院完成。1.1样品、试剂、培养基试验共用到块根块茎类作物样品14份，
8、包括胡萝卜、白萝卜、马铃薯、紫甘 蓝、山药、莲藕、芋头、红薯、生姜、甜菜等。其中5份样品采自农田，9份 样品购自北京蔬菜市场。样品主要为处于成熟期的作物块根块茎。样品信息详 见表1。病原真菌靶标菌株拟枝镰孢(Fusarium sporotrichioides)ACCC37402和尖 镰孢(Fusarium xysporum)ACCC37438由中国农业科学院农业资源与农业 区划研究所邓晖提供，尖镰孢MLS1由笔者实验室提供。试剂主要购自北京化 学试剂公司和Sigma公司。多碳源低氮培养基（CCM ） 11:溶液 I: KH2PO4 0.2 g , NaCl 0.1 g , K2HPO4 0.8
9、 g , Na2Fe EDTA 28 mg，钼酸钠 25 mg，酵母浸膏 100 mg , 甘露醇5 g ,蔗糖5 g ,乳酸钠0.5 mL,蒸馏水900 mL。溶液H: MgSO47H2O 0.2 g,CaCl22H2O 0.06 g,蒸馏水 100 mL。将溶液I、H 分别灭菌，冷却至50C左右混合，加入生物素（5 四L-1 ）和维生素（10 四L-1 ）各0.5 mL。无氮培养基12:蔗糖10 g , NaCl 0.12 g , K2HPO4-3H2O 0.5 g, CaCO3 1 g ,MgSO47H2O 0.2 g,蒸馏水 1 L , pH 7.2。LB培养基：酵母膏5 g，蛋白腺1
10、0.0 g , NaCl 10.0 g，蒸馏水1 L,pH 7.0。1.2内生固氮菌分离采用上述多碳源低氮培养基和无氮培养基，将植物块根块茎样品表面消毒后， 切取内部组织块进行分离培养内生细菌，方法参考文献13。1.3菌株16S rRNA序列测定与初步鉴定细菌分离物16S rRNA基因扩增方法同文献14,序列测定委托北京博迈德生 物技术公司完成，基于16S rRNA基因序列的初步鉴定采用EzTaxon和NCBI 数据库在线比对完成。1.4菌株nifH基因检测与序列测定菌株固氮酶nifH基因扩增方法同文献15,序列测定委托生工生物工程（上海） 股份有限公司完成。1.5内生固氮菌系统发育分析在上述
11、16S rRNA基因序列测定和nifH基因检测的基础上，采用Mega软件 分析块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育16。1.6菌株促生特性测定菌株产生 ACC 脱氨酶（1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid （ACC） deaminase）、产生植物激素IAA（ indole acetic acid）以及拮抗病原真菌的 能力。ACC脱氨酶、IAA以及拮抗病原真菌测定方法同前述7,15,17。拮抗病原真菌 定义抑制率（）=（对照半径r0-对峙培养病原真菌菌落半径r1）/对照半径 r0x100o2结果2.1块根块茎类作物内生固氮菌分离、nifH基因检测及基于16
12、S rRNA基因序 列鉴定从14个块根块茎类作物样品的块根、块茎中共分离到内生细菌219株，全部 菌株检测到了固氮酶基因nifH，从而确认这些细菌是固氮菌。经过16S rRNA 基因序列分析比对初步确定了菌株的分类地位。新分离菌株的编号、来源及其 最大相似性模式种如表1所示。2.2块根块茎类作物内生固氮菌的系统发育分析16S rRNA基因序列比对结果显示，分离到的219株块根块茎类作物内生固氮 菌与已知模式种的最大相似性均在98%以上（42号菌株为97.70% ），说明新 分离内生固氮菌的科学分类地位比较明确。按照16S rRNA基因序列相似性， 219株块根块茎类作物内生固氮菌在系统发育地位
13、上属于24属79种。这24属 分别为 Acinetobacter、Arthrobacter、Bacillus、Brevibacillus、Brevibacterium、Chryseobacterium、Citrobacter、Delftia、Domibacillus、Enterobacter、 Fictibacillus 、 Flavimonas 、 Flavobacterium 、 Microbacterium、Micrococcus、Paenibacillus、Pantoea、Pseudomonas、 Rahnella、 Rhizobium、 Sphingobacterium、 Staph
14、ylococcus、 Stenotrophomonas、Variovorax。以79株最大相似性模式种作为代表菌株进行的系统发育分析结果如图1所示。 总的来看，新分离的219株块根块茎类作物内生固氮菌在系统发育关系上可以 分为5群：第1群包括7个属，分别是Bacillus （其中包含23个种代表77菌 株X Brevibacterium （其中包含1个种代表17菌株）、Fictibacillus （其中包 含4个种代表17菌株）、Paenibacillus （其中包含5个种代表6菌株）、 Brevibacillus （其中包含3个种代表5菌株）.Domibacillus （其中包含1个 种代表
15、1菌株）、Staphylococcus （其中包含1个种代表1菌株），共计38个 种，代表124菌株，分别占分类地位种数和新分离菌株总数的48.10%和56.62%。第2群包括3个属，Microbacterium （其中包含2个种代表2菌 株X Arthrobacter （其中包含5个种代表11菌株）、Micrococcus （其中包 含1个种代表1菌株），共计8个种，代表14菌株，分别占分类地位种数和新 分离菌株总数的10.13%和 6.39%。第3群只有1个属Rhizobium，包括3个 种，代表5菌株，分别占分类地位种数和新分离菌株总数的3.80%和 2.28%。 第4群包括10个属，P
16、seudomonas （其中包含10个种代表29菌株）、 Stenotrophomonas （其中包含1个种代表4菌株）、Delftia （其中包含1个 种代表1菌株）、Variovorax （其中包含1个种代表1菌株）、Flavimonas株X Rahnella （其中包含1个种代表2菌株）.Pantoea （其中包含4个种代 表10菌株X Citrobacter （其中包含1个种代表1菌株X Enterobacter （其 中包含4个种代表11菌株），共计25个种，代表66菌株，分别占分类地位种 数和新分离菌株总数的31.65%和30.14%。第5群包括3个属， Sphingobacterium （其中包含2个种代表3菌株）、Flavobacterium （其中 包含1个种代表1菌株 Chryseobacterium （其中包含2个种代表6
