免疫组化相关步骤

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1、免疫组化操作步骤(一) 、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅(二) 、试 剂1. PBS 缓冲液(ph7.27.4)： NaC137mmol/L, KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2. 0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,ph6.O,1000ml)：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3. 0.5mol/L EDTA缓冲液(ph8.0)： 700ml 水中溶解 186.1g EDTA& 8226;2H2O用 10mmol/L NaOH调至 ph80,加水至 1000ml.4. 1mol/L 的

2、TBS 缓冲液(ph8.0)：在 800ml 水中溶解 121gTris碱，用 1N 的 HCl 调至 ph8.0,加水 1000ml。5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6. 3%甲醇一H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(ph90-95)等量混合b油和TBS(PBS)配制8. TBS/PBS PH9.0-9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本(三) 、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放

3、置60分钟或60C恒温箱中烘烤20分钟。a 组织芯片置于二甲苯中浸泡 10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或 0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(ph6.0).盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金 属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。 10分钟后除去热源，置入凉水中 当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。b沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸

4、橼酸钠缓冲液(ph6.0)至95左右，放入组织芯片加热10-15分钟。c微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。 适用的抗原 Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白

5、酶使用前预热37C，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮 蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN等3、免疫组化染色SP法( 1) 脱蜡、水化(2) PBS洗2-3次各5分钟(3) 3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟( 4) PBS 洗 2-3 次各 5 分钟( 5)抗原修复( 6) PBS 洗 2-3 次各 5 分钟( 7)滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟，甩去多余液体(8) 滴加I抗50但,室温静置1小时或4C过夜或37C1小时(9) 4C过夜后需在37C复温45分钟( 10

6、) PBS 洗 3 次每次 2 分钟(11) 滴加II抗45-500,室温静置或37C1小时(12) 11 抗中可加入 0.05%的 tween-20.( 13) PBS 洗 3 次各 5 分钟(14) DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度( 15) PBS 或自来水冲洗 10 分钟(16)苏木精复染 2分钟，盐酸酒精分化(17)自来水冲洗 10-15 分钟(18)脱水、透明、封片、镜检。4、SABC 法(1) 脱蜡、水化(2)PBS 洗 2次各 5分钟(3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次( 4)抗原修复( 5) PBS 洗 5 分钟(6

7、) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体(7) 滴加I抗50但,室温静置1小时或4C过夜或37C1小时(8) PBS洗3次各2分钟(9) 滴加生物素化II抗，20C-37C 20分钟( 10) PBS 洗 3 次各 2 分钟(11 )滴加试剂SABC 20C-30C 20分钟(12) PBS洗4次各5分钟( 13) DAB 显色：试剂盒或自配显色剂显色( 14)脱水、透明、封片、镜检。免疫组化问题解答1、染色过强a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温 1小时或4度过夜b 孵育温度过高超过 37度 一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高 显

8、色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准2、非特异性背景染色a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜 3%H2O2 封闭孵育时间延长c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间3、染色弱a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60 分钟b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 (应防止切片干燥)d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度 封

9、闭不要超过12分钟4、染色阴性a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误免疫组化操作要点及技巧(1) 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不 同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸， 对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP 液：即高碘酸钠-赖氨酸

10、-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(2) 组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。(3) 切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。(4) 烤片：60-C 30分钟或37C过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。(5) 蜡块及切片的保存：最好在4C保存( 6)脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理(APES

11、和Poly-L-Lysine )的切片。在以 上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1： 50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。(7) 灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。(8) 暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫 组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一 样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。(9) 封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强

12、时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭(10) 抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。(11) 背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1%。Tween20的PBS洗，特 别是在显色之前要多洗。(12) 返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2HP04的饱和溶液返蓝。(13) 显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。(14) 在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。(15) 拍照1) 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程

13、中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。2) 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是， 一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3) 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。 测量其灰度应在 250 左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯 光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。免疫组化技术的关键问题1. 组织处理 恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准

14、备的过程中，不仅要求 保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失， 即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易 出现假阳性结果。1) 组织及时取材和固定 组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要 适中，一般在2.5cmX2.5cmX0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能

15、厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm X5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm,否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时 间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做 到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处 理是采用 10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固 定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。2) 组织脱水、透明、浸蜡 组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色 抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lhX3次，二甲苯透 明lhX2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65C。2. 切片组织得到很好处理后在进行