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1、水稻转基因系的分子鉴定1目的1.1 从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转 基因株，为根系和生理学实验提供材料；1. 2 鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；1. 3 鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。2. 材料中华 11 （ CK）H05 系列石狩白毛（CK）E10 系列WD17 系列3. 主要试剂和配方3.1 DNA微量提取微量提取液：200mM Tris-HCl（pH7.5250mM NaCl25mM EDTA0.5% SDS酚/氯仿氯仿无水乙醇、 70%乙醇TE缓冲液（pH8.0）10mg/ml RNase3.2 Htp的PCR鉴定
2、Taq酶及Buffer购自Takara公司dNTPs 购自华美公司3.3植物DNA大量提取抽提液：1.5%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）75mmol/L Tris-HCl PH8.01M NaCl15mmol/L EDTA沉淀液：1%CTAB50mmol/L Tris-HCl PH8.010mmol/L EDTA高盐 TE:1mol/L NaCl10mmol/L Tris-HCl PH8.01mmol/L EDTA3. 4 Southern 杂交Southern杂交液(lx) :20xSSC250 mL5%SDS5 mL10%Sarkosyll0 mLddH O735 mL2Blocking
3、 Reagent5 g洗脱液(lx)：20x SSC10 mL5%SDS40 mLddH O950 mL23.5 RNA提取Trizol：购自 Invitragen公司10xMOPS:80mmol/L NaAc0.2mol/L MOPS10mmol/L EDTA加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0RNA上样混合物：0.25%溴酚兰0.25%二甲苯菁50甘油1 mmol/L EDTA1.2% 甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose73ml DEPC 水 10xMOPBuffer 10 mL 2.2M 甲醛6 mL3.6 RT-PCR反转录酶Superscrip till试剂盒购自In
4、vi tr agen公司 PCR所用试剂同前。3.7 Norther n分析Northern杂交液(1X)：2OXSSC25 mL10%SDS5 mL10%Sarkosyl5 mL1MTrisHcl(ph7.5) 5mlddH2O10 mLBlocking Reagent 1 g甲酰胺50mL4方法4. 1 DNA微量提取取水稻幼小叶片约 5cm 长,加液氮研磨后加微量抽提液 400ul 摇匀，加等体积的酚/ 氯仿摇匀后放置10分钟，5500rpm常温离心10分钟，取上清液于另一个新管，加400ml 氯仿摇匀放置5分钟，5500rpm常温离心10分钟，取上清液于另一个新管，加2倍体积 无水乙醇
5、沉淀5分钟，离心3分钟后弃上清液，70%乙醇洗2次，风干后30U10.5XTE溶 解， 4C 保存备用。4. 2转基因系的PCR鉴定取适量转化苗DNA进行htp基因的PCR反应，反应总体积为25ul,30个循环，产物于 1.3%的琼脂糖凝胶电泳检测，初步鉴定转化苗。样品：阴性对照：阳性对照：样 品：PCR反应液组成：引物：0.5uMdNTP:100uMBuffer:2.5ulTaqE:1UDNA:20-100ngddH2O:add to 25ulPCR 条件：94C 9 4C 58C 72C 7230 cycles2m 30s50s 1m 5m引物序列：htpF1: GTCTCCGACCTGA
6、TGCAGCTCTCGGhtpR1: GTCCGTCAGCACATTGTTGGAG4. 3 插入拷贝数与插入方式的确定4.3.1转基因植株DNA的提取（CTAB法提取）将PCR鉴定的转基因株分单株取叶片35g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片 研磨成粉末，倒入50m L离心管中。加入20m L预热到80C的CTAB提取液摇匀。56C水 浴保温1520分钟，并经常拿出来摇动几下。加入15m L氯仿，摇匀后，平放在摇床上剧 烈摇动10分钟。室温下3500rpm离心15分钟。移上清液至另一离心管，加入1/10量的10% CTAB，摇匀。加入15m L氯仿，混匀后，在摇床上激烈摇动15分钟。室温下3
7、500rpm离 心15分钟，移上清至另一离心管，加入等量的沉淀液，摇匀后放置1015分钟。将沉淀的 絮状物用牙签勾起，倒尽上清并尽可能地把残液吸除（如果沉淀量少，则用 3500rpm ，室 温下离心 10分钟，弃去上清液并用移液器将残液尽可能除去）用吸管头将沉淀扩散到管壁 上，加入35m L高盐TE和0.05mg RNA酶。在65C摇床中轻摇至完全溶解。加入2倍体 积无水乙醇，摇匀。用牙签钩出DNA,经70%乙醇漂洗，风干后溶于0.20.5m L TE。取 1此溶液和标准浓度的九DNA 起在0.8%琼脂糖凝胶中电泳检测DNA质量。4.3.2 酶切转膜选用HindiII限制性内切酶酶切转化植株总
8、基因组DNA, 37C酶切12小时左右。先取 少量进行预电泳检测酶切效果，然后用0.8%的琼脂糖凝胶进行低电压电泳或反转电泳。电 泳后将大片段的凝胶部分用紫外灯照射15分钟左右，再用0.4 mol/L NaOH进行碱法转移8 12小时，将胶上的DNA转移到Hybond-N+尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜放入一干净盒 子,先用2xSSC溶液简单漂洗后，再用煮沸的0.5% SSC/0.5% SDS溶液倒入，摇动数分钟， 重复两次。用微波炉烤3 分钟或在紫外交联仪上交联1 分钟，之后用保鲜纸把膜包好， 4C 下保存备用。4.3.3 探针获得及标记探针采用随机引物法标记，体系为25p L。取50lOO
9、ng已回收好的HPT PCR产物为模 板，加入2p L （0.5 g/ L）随机引物和lng的入DNA，补充ddO至10p L后，放入加热板 或PCR仪95C变性3分钟，取出立即冰浴5分钟。然后加入2.5p L标记缓冲液（含dATP、 dGTP、dTTP）、2U的BST聚合酶、3050p Cia -32P-dCTP, 65C反应0.5小时，反应完后加 入等体积的 0.8 mol/L NaOH 将探针进行碱变性。434 预杂交及杂交按0.20.5 L /m2杂交膜面积的量，将杂交液加入放有尼龙膜的杂交管中，65C预杂 交12小时，然后将变性后的探针加入到杂交液中,65C杂交炉中杂交过夜（1416
10、小时）。435 洗膜及杂交信号检测杂交完后，先用少量洗膜液（0.2XSSC / 0.1% SDS）室温下冲洗一次，然后用预热至 65C 的洗液在摇床中洗约30分钟，更换洗液再洗3060分钟。洗完膜后，用保鲜膜包好， 压上分子磷屏。12小时后，用BIORAD FX成像系统扫描，分析杂交结果。436 探针的洗脱 磷屏扫描后，将杂交膜从保鲜膜中取出，放入煮沸的洗膜液中，继续煮数分钟至信号 降至本底为止。已洗脱探针的尼龙膜可以重复使用。44 插入旁侧序列获得及插入位点的确定用刘耀光教授发明的TAIL-PCR方法获取插入点旁侧基因组序列，右边界旁侧序列扩增 第1、2、3轮特异引物分别用NOS3b、Nos
11、3c、Nos3d,左边界旁侧序列扩增第1、2、3轮特 异引物分别用35S-1、35S-2、35S-3，兼并引物用AD2a或AD2或AD2c （具体见后）。扩增产物回收并测序，用序列在水稻数据库中搜寻BAC/PAC序列，即可确定插入的位点。TAIL-PCR 所需引物：AD2a:5 NTGCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3AD2b:5 NTGCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3AD2c:5 NTGCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA 3Nos3b:5 TGCATGACGTTATTATGAGAGATGGGTT 3Nos3c:5 TATGATTAGA
12、GTCCCGCAATTATACA 3Nos3d:5 ATTATCGCGCGCGGTGTCA335S3-1:5 TAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCA 335s3-2:5 GTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAG 335s3-3:5 CCTAAAACCAAAATCCCTTAG 3TAIL PCR 所需的程序及反应体系ReactionCycle no.Thermal condi tionPrimary194 C3min594 C30s,65C1min,72C 3min194C30s,30C2min,ramping to72Cover2min, 72C 3min1594C 1
13、5s,65C 1min,72C 3min94C 15s,65C 1min,72C 3min94C 15s,45C 1min,72C 3min172C5minSecondary1594C15s,65C 1min,72C 3min94C15s,65C 1min,72C 3min94C15s,45C 1min,72C 3min172C5minTertiary2094C15s,45C 1min,72C 3min72C5min反应体系PrimarySecondaryTerti aryVolumeTemplate20卩LRice genome DNA 20ng25卩L1/800reaction50卩LPr
14、imary 1/250 Secondary reaction10X Buffer2卩L2.5卩 L5卩LdNTP100卩M each100卩M each100卩M eachSpecific0.15卩 M(MR1 or TR1)0.2 卩 M(MR2 or TR2)0.2卩M(MR3 or TR3)primerAD2a primer2卩M1卩M1卩MTaq1U0.8U1.5U45 目的基因表达（干涉效果）的检测4. 5. 1转化植株总RNA的抽提分单株选取lOOmg转化植株叶片在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5mL离心管，加 入ImLTriZOL提取液振荡混匀。5分钟后，加入0.2mL的氯仿，剧烈摇动15秒，30C反应 23分钟。在12000Xg条件下，8C离心15分钟，溶液分为两层，上层为溶有RNA的无色 液层，下层为酚-氯仿浅红色液层。将上层液体移入RNA专用1.5mL离心管，再加入0.2mL 的氯仿混匀、离心。移上清至另一新的干净离心管，加入0.5mL异丙醇，30C沉淀10分钟, 然后在12000Xg, 8C离心10分钟沉淀RNA。去掉液体，加
