反硝化能力的测定

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1、摘要：为深入研究一农田系统中的反硝化过程，本课题进行了农田土壤样本的反 硝化细菌分离和16S rRNA基因鉴定，并分析了它们的反硝化能力与反硝化基因。 通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力 的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，硝酸盐降解率最高为100%， 最低为66.76%。对8株分离的反硝化菌株的DNA进行反硝化基因nirS和nosZ 进行PCR扩增，结果发现有三株菌株含有nosZ基因，均未检测到nirS基因。对 分离的反硝化菌株的16S rDNA进行PCR扩增，通过克隆建库和阳性克隆测序 的方法对分离菌株进行了分类地位的分子鉴定。结果表明分离的菌株

2、属嗜水气单 胞菌(Aeromonas hydrophila)、中间气单胞菌(Aeromonas media)、居泉沙雷氏 菌(Serratia fonticola)。而居泉沙雷氏菌没有有反硝化能力的报道，对我们增加 对反硝化细菌的认识有很大帮助。关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选，反硝化基因1、绪论：反硝化作用(denitrification)也称脱氮作用。反硝化细菌在缺氧条 件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮(N2)或一氧化二氮(N2O)的过程。大 部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物 为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示： C6H12

3、O6+12NO3-6H2O+6CO2+12NO2-+能量CH3COOH+8NO3- 6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农 业生产不利。农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用。 反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋 中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用。所以我们应尽量发挥其有 利的一面，为人类所利用。反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验 证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在。 由于N2O和N

4、O都是温室气体，是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且 重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气1。本 实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有 nirS和nosZ基因，对此进行综合分析，找出在农田土壤中发挥反硝化作用的不 同的菌株，为了解土壤中的反硝化机制奠定基础。分离的菌株将有可能具有应用 前景。例如，nosZ基因活性较强的菌株将对农田等生态系统中其他微生物产生 的N2O和NO等温室气体还原，减少温室气体的排放，为维持环境的稳定起到 积极作用。2、实验材料与方法2.1本研究所用的土壤样品采自挪威的农田。挪威农业发展中心于1978年

5、 开始向当地泥炭土中添加冰碛土(moraine soil)和贝壳砂(shell sand)改良土壤。 本次实验所用土壤即来自于改良项目中的一项(每公顷添加800m3贝壳砂)，经 近三十年的改良，土壤的pH已从4左右上升到了 8左右，土壤肥力等方面都有 所改善。挪威农业大学对该农田地块进行了为期三十年的长期监测，积累了大量 的农田的理化和农业数据。22.2培养基：LB液体培养基(每1000ml) 10g蛋白胨5g酵母提取物10g NaCl若加 入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分。一TSA培养基 胰蛋白胨0.75g/L大豆胨 0.25g/L NaCl 0.25g/LGiltay培养基：A溶液：K

6、NO3 1.0g。天冬酰胺1.0g, 1%BTB酒精溶液5mL,蒸馏水500mL B 溶液：柠檬酸钠 8.5g , MgSO4.7H2O 1.0g, FeCl36H2O 0.05g, KH2PO41.0g, CaCl22H2O 0.2g，蒸馏水 500mL,混合A、B溶液，加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7.1,灭菌备用2.3仪器、试剂：普通离心机、超净台、恒温培养箱、摇床、高压蒸汽 灭菌锅、电子天平、紫外分光光度仪、实验所用化学药品均为分析纯。2.4初筛：先将土壤样本稀释100倍作为样本。提取样本，稀释为10-3、 10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 六个梯度，各 5

7、00 微升。其中，10-5、10-6、10-7 三个浓度各涂两个平板，其余各涂一个平板。再加上10-2浓度在平板上进行划 线，总计10个平板。平板上培养基为TSA培养基。然后将平板放入厌氧培养箱 中18笆培养一个星期。2.5菌落集中培养：另取一平板，在其背面贴上50格的方格纸，然后从 10-6和10-7的平板上挑取菌体分别接种在每个格子的左上（记为A）和右下方 （记为B）。（其上菌落的编号方法：方格号+位置，例：10A、44B）。共计100 个菌落。将此平板与先前各平板一道放入厌氧培养箱继续培养一周。此平板记作 此平板记作此平板记作此平板记作“平板平板平板平板A”2.6复筛：使用移液枪头挑取平板A上较明显且较有代表性的10个菌落 接种进预先加好Giltay培养基与BTB的大试管内，记下编号，培养一周。接种 到大试管中的细菌编号：17A、17B、19A、19B、23A、23B、38B、41A、42A、 43A。BTB 变蓝的试管编号：17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A、43A。 将所有平板密封放入冰箱保存，将大试管放入振荡培养箱继续培养。一周后，提 取大试管中的培养液，开始测量硝酸盐的降解程度。此时，菌已在大试管中培养 三周（28C）。使用仪器为紫外分光光度仪，波长为220nm与275nm。记录实验 数据，将结果进行数学模型拟合，推算出硝酸盐降解程度。