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1、实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法一、目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理1. 简单染色法：用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识
2、别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。2. 革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫碘复合物被保留在细胞内而不
3、易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain)。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细
4、胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)1220h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜
5、等。四、操作步骤1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养1416h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。2. 干燥 室温自然干燥。3. 固定 固定时通过火焰23次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。4. 染色（1）简单染色法： 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色12min；石炭酸复红或草酸铵
6、结晶紫染色约1min。 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 镜检 涂片干燥后镜检。（2）革兰氏染色法： 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约12min，水洗。 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约2030s，立即用水冲净酒精。 复染 用番红液染12min，水洗。 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开
7、的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。(3) 混合涂片法：按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。二、基本原理芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或
8、椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质
9、，其主要成分是多糖类，不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。三、器材枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢杆菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus)约2d无氮培养基琼脂斜面培养物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。荚膜染色液：绘图墨水，1甲基紫水溶液，1结晶紫水溶液，6葡萄糖
10、水溶液，20硫酸铜水溶液，纯甲醇等。四、操作步骤（一）荚膜染色技术方法一：（1）将培养24h左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2）滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45min。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染10min。（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。（5）用番红水溶液复染1min，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。方法二：（1）取两支洁净的小试管，分别加入0.2mL无菌水，再往一管中加
11、入23接种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入23接种环的生孢梭菌的菌苔，两管中各自充分混合成浓厚的菌悬液。（2）在菌悬液中分别加入0.2mL苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热35min。（3）用接种环分别取上述混合液23环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95乙醇冲洗至无红色液流出。（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。（5）取12接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。（二）荚膜染色技术1. 湿墨水法（1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。（2）加盖玻片
12、 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。（3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。2. 干墨水法（1）在载玻片一端滴一滴6葡萄糖水溶液，取少许培养了72h的圆褐固氮菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。（2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。（3）用纯甲醇固定1min。（4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染30s，以细水流适当冲洗，吸
13、干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。3. Anthony法（1）涂片 按常规取菌涂片。（2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。（3）染色 用1结晶紫水溶液染色2min。（4）脱色 以20硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。（5）镜检 干后用油镜观察菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察一、目的要求1. 学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。2. 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。二、基本原理鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项这要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.010.
14、02m，所以，除了很少数能形成鞭毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难
15、以区分。三、器材苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiengsis)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，金黄色葡萄球菌；硝酸银鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01美蓝水溶液；载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡士林，显微镜等。四、操作步骤（一）鞭毛染色技术1. 硝酸银染色法（1）菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种12次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，2832培养1830h，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色观察的菌种材料。良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。（2）载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净，沥干后置95乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）（3）菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有12mL无菌水的试管中
