《真菌对几种杀菌剂的抗性机制研究.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《真菌对几种杀菌剂的抗性机制研究.doc（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、真菌对几种杀菌剂的抗性机制研究摘要：苯并咪唑类杀菌剂通常被认为是一类高抗药性风险的药剂，主要是由于这类药剂作用靶标单一，病原菌很容易发生抗药性突变；另外，该类药剂由于有很好的杀菌活性和教宽的防治谱，在过去的一段时间内被大量单独使用,已在自然界形成很高的选择压力；二甲酰亚胺类杀菌剂是20世纪70年代初推出的一类广谱、触杀型、保护性杀菌剂，也有一定的治疗作用，对真菌的孢子萌发、菌丝生长都有抑制导致菌丝顶端产生不正常的分枝和肿胀，最近研究表明双组份组氨酸激酶的点突变可能是此类杀菌剂对病原菌产生抗性的机制；甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是一类重要的新型杀菌剂, 具有广谱、高效、安全的特点。这类杀菌剂作用于真菌
2、线粒体的电子传递链的复合物三，阻止电子传递，抑制能量合成。由于作用位点单一，易产生抗药性，其抗药性机制主要是细胞色素b基因序列上发生点突变。关键词：苯并咪唑类 二甲酰亚胺类 甲氧基丙烯酸酯类 杀菌剂 抗药性苯并咪唑类（benzimidazoles）化合物是上世纪60年代后期开发的一类非常重要的药剂，被广泛应用于农用杀菌剂、兽药及临床抗癌药物。苯并咪唑类药剂中最大的一类为农用杀菌剂，对大多数子囊菌、半子菌和担子菌引起的病害均有防治效果，又因为该类药剂被首先发现具有植物内吸性，对病害具有治疗作用，该类药剂的开发被认为在植物病害化学防治上具有里程碑式的意义。我国从上世界70年代仿制多菌灵成功以来，该
3、类药剂一直被广泛应用于一些重要农作物主要病害的控制。该类杀菌剂主要作用于病原菌的-微管蛋白，阻止纺锤丝的形成，从而干扰细胞核的分裂。因此这类药剂作用位点单一，选择性较强，病原菌在药剂选择压力下很容易产生抗药性。据统计，到1987年止，至少有55个属的病原菌对苯并咪唑类杀菌剂产生了抗药性1 。目前由于其突出的抗药性问题，苯并咪唑类杀菌剂的应用范围及前景受到很严重的制约。苯并咪唑类化合物的母体结构中都含有一个苯并咪唑环的活性基团，主要品种有多菌灵（carbendazim）、苯菌灵（benomyl）、噻菌灵（thiabendazole）、麦穗宁（fuberidazole）等，另外由于甲基托布津（th
4、iophanate-methyl）在生物体中主要代谢为多菌灵而起作用，因此也将其归入这类化合物2 。最初，Hastie研究发现3 苯菌灵能使构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的核不稳定，因此推测苯并咪唑类药剂可以干扰病原菌的核酸物质的合成。但后来的研究表明4-6 ，该类杀菌剂可以使细胞核的分裂受阻，而抑制核酸物质的合成只是核分裂受阻的结果。苯菌灵在处理菌丝后，细胞呈现类似于秋水仙素处理植物或动物细胞后的现象，而秋水仙素主要是通过干扰纺锤体的形成进而破坏哺乳动物或植物细胞的有丝分裂7。由-微管蛋白和-微管蛋白组成的异二聚合体是组成微管的最基本的单元，而微管进一步可组装成为纺锤丝
5、，而纺锤体的形成以来纺锤丝将处于赤道板的染色体往细胞两极牵引8 。当细胞用秋水仙素处理后，由于不能形成纺锤丝，使得有丝分裂过程停滞在细胞分裂中期，每个染色体复制的两个姊妹染色单体虽然分开了，却不能彼此往两极分离，不能形成两个子核，于是该细胞内的染色体就加倍了。遗传上可以采用此染色体加倍的原理使用秋水仙素进行多倍体育种。真菌的微管对秋水仙素不敏感，出现该现象可以说明苯并咪唑类药剂具有与秋水仙素相同或相似的作用机理。Nocodazole是一种与多菌灵的结构类似的化合物，最初被作为抗癌药物应用于临床试验。该化合物能强烈抑制哺乳动物细胞的有丝分裂9 。研究表明，nocodazole对哺乳动物微管的干扰
6、作用与秋水仙素类似，能与秋水仙素竞争性地和哺乳动物的-微管蛋白结合10 。同时，试验也发现nocodazole与多菌灵可与真菌的微管蛋白竞争性结合7 ，这说明多菌灵也作用于-微管蛋白。Davidse11用14C标记的多菌灵与构巢曲霉的菌丝粗提蛋白进行离体结合试验，发现多菌灵可与微管蛋白类似物发生结合，且结合能力与构巢曲霉对多菌灵的敏感性有关，来自对多菌灵敏感的构巢曲霉菌株的-微管蛋白与多菌灵的结合能力比来自多菌灵抗药性菌株强。Howard等对Fusarium acuminatum菌丝进行药剂处理后观察菌丝尖端发现，药剂处理后菌丝生长受到抑制，所有的有丝分裂在中期停滞，同时微管稳定剂D2O对多菌
7、灵具有颉颃作用，说明多菌灵作用于真菌的微管，并且使微管更不稳定，易于分解12-13 。Knkel对构巢曲霉萌芽分生孢子有丝分裂的超微结构的观察发现，用多菌灵处理后无纺锤体形成14。此外，更多的苯并咪唑类药剂作用于真菌的-微管蛋白的证据来源于对许多病原菌抗性的生化机制和分子机制方面的研究15。苯并咪唑类杀菌剂通常被认为是一类高抗药性风险的药剂，主要是由于这类药剂作用靶标单一，病原菌很容易发生抗药性突变；另外，该类药剂由于有很好的杀菌活性和教宽的防治谱，在过去的一段时间内被大量单独使用,已在自然界形成很高的选择压力。这类药剂在20世纪60年代后期问世，在1969年，Schroeder等18 就首次
8、报道了黄瓜白粉病菌产生对苯菌灵的抗药性。据统计，到1987年止， 至少有55个属的植物病原菌对这类药剂产生了抗药性1。病原真菌通常对苯并咪唑类杀菌剂的抗药性发展较快，在使用这类药剂1至3年就能在田间检测到抗药性菌株，如灰霉病菌（Botrytis cinerea）19 、苹果黑星病菌（Venturia inaequalis）20。但在大麦眼斑病菌（Pseudocercosporella herpotrichoides）21 中使用这类药剂10年后、在大麦云纹病菌（Rhynchosporium secalis）22 中使用15年之后、在用多菌灵防治小麦赤霉病菌（F. graminearum）近20
9、年之后才在田间检测到首例抗药菌株23 。 从以上现象可以大致得到以下推论，灰霉病菌可在作物的生长季节中多次循环侵染，在一个生长季单一大量使用苯并咪唑药剂防治病害容易形成很大的选择压力，病原菌容易产生抗药性；而如小麦赤霉病菌（F. graminearum）等在小麦生长季节只需要在防治适期用药一次即可，药剂选择压力较弱，不容易产生抗药性问题，或延缓了抗药性出现的时间。苯并咪唑类药剂的抗药病原群体在田间发展速度较快，药剂的选择作用是其中一个原因，另一个主要原因是大多数病菌对这类药剂的抗药突变体通常适合度较高，有较强的生存竞争能力，如灰霉病菌24 、小麦赤霉病菌25 等的抗药菌株在无性繁殖、有性生殖能
10、力、生长速率、致病性等方面与野生敏感菌株无明显差异，有的抗性菌株在药剂停止使用多年后，仍能检测到。与-微管蛋白亲和性的降低被认为是病原菌对这类药剂产生抗性的生化机制。大量研究结果表明病菌对苯并咪唑类药剂的抗性与-微管蛋白的变化有关，研究者推断病原菌与药剂亲和性下降可能和-微管蛋白上某些特定氨基酸的改变有关。Jung等（1990，1992）克隆了构巢曲霉抗药突变体的benA基因，该基因的突变能使病菌对噻菌灵产生抗性，而对nocodazole、多菌灵、苯来特等更加敏感，测序比较发现，该基因的突变使得-微管蛋白上的165位置上的丙氨酸突变成了缬氨酸，后来对更多室内诱导的构巢曲霉的抗药突变体研究发现，
11、-微管蛋白上第6、198、200等位置上氨基酸的改变也能导致抗性的产生。Jung和Oakley检查了苯菌灵抗性突变区域在不同生物体间的保守程度，因为所有的-微管蛋白是高度同源的，在长度上类似。研究了哺乳动物、昆虫、植物、真菌、藻类和原生生物的44个-微管蛋白氨基酸序列，结果发现第6位和第198位氨基酸是高度保守的，第6位的组氨酸存在于41/44个序列中，第198位的谷氨酸存在于43/44个序列中。由于这两个位点的氨基酸在遗传背景如此不同的生物体中有如此高的保守性，这些氨基酸的改变很可能会引起一些不利的选择性，然而这些选择性上的不利是很小的，并不引起生长和产孢的明显下降。第165位上差异大，但所
12、有真菌均为丙氨酸。在200位具有特定于各个门的差异，这解释了不同门的生物体对苯菌灵的敏感性。真菌一般对苯菌灵敏感，所测的各个真菌-微管蛋白在第200位为苯丙氨酸，酪氨酸代替苯丙氨酸导致了对苯菌灵的抗性。大部分哺乳动物为酪氨酸，可以解释为什么哺乳动物对苯菌灵不敏感。植物对苯菌灵及其他苯并咪唑类杀菌剂也很不敏感，其第200位为甲硫氨酸或丝氨酸。Oakley等研究认为构巢曲霉-微管蛋白第50、134或257位的氨基酸突变也可以产生对苯菌灵的抗性。Fujimura（1992）研究发现，对多菌灵产生抗药性的粗糙脉孢霉菌株的突变连锁于编码-微管蛋白的Bm1位点；第198位不同的氨基酸替代可导致对乙霉威不同
13、程度的敏感性，谷氨酸（最不敏感）赖氨酸丙氨酸甘氨酸（最敏感）；-微管蛋白第250位的苯丙氨酸和第237位的丙氨酸影响了该菌株对乙霉威和多菌灵的抗性。Fujimura（1994)进一步研究认为，-微管蛋白165167、237250位的氨基酸控制着对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的抗药性，导致菌株对两者之间的正交互抗性；而第198位氨基酸对苯并咪唑类杀菌剂和乙霉威的负交互抗性起着重要作用；在第198位，谷氨酸的大小和电荷有利于-微管蛋白与多菌灵的结合，而更小的一些氨基酸利于乙霉威与-微管蛋白结合。Koenraadt（1993)发现粗糙脉孢霉对苯菌灵抗药性菌株的-微管蛋白第198位和200位氨基酸突变，第
14、198位由谷氨酸突变为丙氨酸，第200位氨基酸由苯丙氨酸突变为酪氨酸。提取对苯菌灵具有抗药性的粗糙脉孢霉菌株-微管蛋白基因，构建载体，转化到对苯菌灵的敏感菌株中，转化子对苯菌灵表现为抗性。粗糙脉孢霉中-微管蛋白第198位和200位的点突变也引起对苯菌灵的抗性，第198位的丙氨酸与菌株对乙霉威的敏感性相关。目前所获得的多种具有对苯并咪唑类杀菌剂田间抗药性的植物病原真菌菌株中，氨基酸突变仅仅出现在两个位点：198和200。如-微管蛋白198位氨基酸由谷氨酸（Glu）突变为丙氨酸（Ala）是导致S.sclerotiorum产生对多菌灵田间抗药性的主要原因（李红霞，2002、2003）。其原因可能是-
15、微管蛋白中其他位点的突变与真菌的适合度的降低有关，大田条件下给这些突变体带来选择上的不利，从而导致生存能力的下降，无法在田间存活。如在第50、134、257位突变的构巢曲霉对苯菌灵的抗性菌株都具有温度敏感性，适应性下降。但Kawchuk等（2002）报道了引起贮藏期马铃薯干腐病菌（Gibberella pulicaris)的-微管蛋白第40、144、226、307、312和354位氨基酸密码子发生变化，但与噻菌灵抗性无关。大多数病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性是由单个主效基因-微管蛋白基因控制的，且该基因的不同碱基发生突变或同一碱基发生不同的突变可以使病菌对药剂产生不同的抗药性水平，如灰霉病菌（F
16、aretra和Pollastro，1991）、苹果黑星病菌（Shabi和Katan等，1983）等。但也有例外，如在尖镰孢（Fusarium oxysporum）（Molnar和Hornok等，1985）和意大利青霉（P. italicum）（BerahaGarber 和Garber，1980）中，高水平的抗性受两个主效基因控制；Stover等发现在Mycosphaerella fijiensis var. difformis和M. musicola中（Stover，1977），除染色体基因外，一些胞质因子也与抗性有关。二甲酰亚胺类杀菌剂（dicarboximide fungicides, DCFs），如乙烯菌核利（vinclozolin）、菌核净（dimethachlon）、速克灵（procymidone）和扑海因（iprodione)等是2
