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1、拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定【摘要】 拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。实验将获得T-DNA插入某基因造成的突变种，插入基因功能进行判断。筛选出纯种突变型，同时进行PCR法序列鉴定纯种突变型、杂种突变型与野生型。1.引言：反向遗传学：经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生
2、物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。实验材料拟南芥：拟南芥又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；种子多，每株每代可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体；拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。拟南芥全部基因组测序已经完成，每
3、个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。突变体获得：插入诱变（insertional mutagenesis），即将外源DNA随机插入到拟南芥基因组中，获得突变体。当外源DNA“击中”某一基因时，这个特定基因就被关闭。常用的插入诱变方法为农杆菌转化法。Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因
4、放进T-DNA区段中，可通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。特定基因突变体的获得：北卡罗莱纳州立大学的遗传学助理教授Jose Alonso博士的研究小组创造出分别敲除某个基因的不同拟南芥品系。这些拟南芥的种子保存在俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心的种子贮存中心。现在，特异性敲除基因的拟南芥种子库已经创建，向全世界的科研人员开放。研究一个特定基因的研究人员可以迅速、便利地在种子文库中搜索该基
5、因被关闭的拟南芥品系，然后向拟南芥生物资源中心订购。推荐精选三引物法鉴定T-DNA插入突变体：三引物法的原理下图所示，即采用三引物(LP、RP、BP)进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约1100 bp (即从LP到RP)；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25 kb，过长的模板会阻止目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为560-860bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同
6、时得到两种产物。上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。双引物法的基本原理与三引物法相似，只是需要急性两轮PCR扩增。一组以基因组DNA特异引物LP和RP扩增目的基因片段；另一组以T-DNA 的特异引物BP与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段。此法的不足之处是完成最终鉴定需进行两轮PCR扩增。由于三引物法容易导致PCR反应体系的引物浓度过高，形成引物二聚体或形成非特异性扩增，导致结果不理想，所以采用二引物法进行实验。 图一：三引物法原理图 琼脂糖凝胶电泳：DNA含有PO43-基团，在pH8.0
7、Buffer中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。这样就可对DNA的分离情况进行直接观察。2.实验方法：2.1 DNA提取： 2.1.1 用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65的600l
8、的2CTAB提取液，轻摇混匀。 2.1.2 65水浴30 min，其间轻摇混匀。 2.1.3 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。 2.1.4 向上清液中加入2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 推荐精选下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 2.1.5 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 2.1.6 将沉淀晾干(37 3-5min),加20-50lTE (pH 8.0，加入量视DNA的量而定)， 65水浴30 min溶解DNA。2.2 PCR扩增：
9、PCR有变性-退火-延伸三个基本反应步骤，选取适当的PCR体系对提取的DNA进行扩增。表一：PCR反应体系试剂加量（l）加量（l）加量（l）ddH2O15161610Tap buffer(Mg2+ free)2.52.52.5MgCl2（25mM）222模板DNA（30-50ng/ul）222引物LP（10um）11引物RP（10um）11引物BP（10um）111dNTP(各2.5mM)0.50.50.5Tap酶（5U/ ul）0.20.20.2反应体系总体积252525表二：PCR扩增程序过程温度/35次循环时间预变性945min变性9440s退火5350s延伸7280s延伸后处理7210
10、min 2.3 琼脂糖凝胶电泳：选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，电泳分离不同大小的DNA片段；同样条件对Maker电泳，起到鉴定的作用。经溴乙锭（EB）染色后在紫外灯下观察条带的有无及分离情况。3.实验用品：3.1实验材料 拟南芥3.2实验试剂CATB法提取DNA：液氮、2CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇=24：1、无水乙醇、70%乙醇、TEPCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、Taq DNA聚合酶推荐精选电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE3.3实验器具 恒温水浴锅，离心机、离心管、移液枪、PCR仪、电泳仪、紫外灯
11、、冰箱、液氮罐、镊子4. 实验结果及分析： Maker 22号 40号 BP RP 3引物 BP RP 3引物 描述分析：我选取的拟南芥是第22号和第40号。从电泳图可以看出，22号的三引物的PCR产物几乎没有，40号的三引物PCR产物条带有多条，应该是发生了干扰，两株植物都不能通过三引物法准确鉴定出是野生型还是纯合突变体还是杂合突变体。从双引物的电泳结果可以看出，22号和40号都有1000bp左右的大带和750bp左右的小带，说明不仅扩增出了目的基因还扩增出了插入片段，从而说明22号和40号拟南芥都是杂合突变体。最下面的亮带是引物二聚体。5.实验总结及注意事项 本次实验的效果比较理想，成功地
12、鉴定出了22号和40号植株为杂合突变体。本次试验，我们学习了植物基因组的提取，在植物基因组的提取过程中，关键步骤是要破裂细胞壁，并将植物细胞中除DNA、RNA以外的杂质及蛋白质去除干净。这就需要在有机溶剂萃取的步骤中注意适当的将液体摇匀，并且在分层的液体中吸上清液时切不可将中间的白色膜状物质及下层绿色液体吸出。学习了PCR扩增技术，在PCR操作过程中，PCR反应体系中有合适的引物并且各组分的比例适当才能保证获得理想的特异性扩增结果。DNA模板纯度要足够，蛋白质、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应，模板要保持完整性，模板降解会导致PCR扩增无产物，浓度适当，加量过多导致非特异性扩增增加；引物最重要
13、的是其特异性，长度适当、避免二级结构和二聚体，保持完整性，避免反复冻融，浓度应适当，过高导致非特异性增加，过低则扩增产物太少；Buffer的pH、盐离子浓度要合适，另外添加适当的稳定剂和增强剂；Mg 2主要是抑制DNA酶的活性，其浓度要适当，过高非特异性严重，过低无扩增产物；dNTP浓度适当，过高则非特异性扩增增加，过低则PCR产物偏低，避免反复冻融；ddH2OpH值适当，避免污染；DNA 聚合酶纯度要足够高，并且热稳定性要好。由于实验时各组分的量都比较少，因此操作添加时一定要准确，可将液体加到管壁上再离心混合均匀。推荐精选在琼脂糖凝胶电泳技术中，首先要学会根据点样的DNA片段的大小选择合适的
14、琼脂糖浓度及Marker。操作过程中要注意规范，点样时既要注意不能把点样孔戳穿又要注意点样不能太过上以免样品侧漏。EB染色时注意保护好自己，切不能粘在皮肤上。参考资料：1 马艺沔 毛国红 汤文强 宋水山 利用三引物PCR和同尾酶连接的策略实现多基因片段的重组 河北省科学院学报 2004,21(3):57-612 阮燕晔 张莹 王波 拟南芥atcwinv1基因T_DNA插入纯合突变体PCR鉴定及表型观察 河南农业科学 2011,40（5）：62-663 李敏 杨双 阮燕晔 樊金娟 张立军 拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3 的 PCR鉴定 植物生理学通讯 2006,4（1）：91-944 邓朝阳 宋贵生 徐军望 朱祯 一种简单易行的重组方法三引物PCR法 科学通报 2002，,47（16）：1247-12495 百度百科“拟南芥”词条 （注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!） 推荐精选
