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1、浅论shRNA干扰VEGF表达对白血病细胞多药耐药的影响【摘要】 目的： 探讨血管内皮细胞生长因子与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞多药耐药的关系及其机制。方法： 针对VEGF基因设计合成3条干扰片段shRNA1，2，3，采用脂质体2000分别将其转染入K562/A02细胞，RTPCR法检测VEGF和多药耐药相关基因MDR1，MRP1，topo，GST的mRNA水平；蛋白质印迹法检测VEGF蛋白水平；MTT法检测各组细胞对多柔比星的半数抑制浓度。结果： K562/A02细胞VEGF mRNA表达水平显着高于敏感株K562细胞，差异有统计学意义，且VEGF蛋白水平也显着高于K562细胞；转
2、染shRNA后，K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调，其中shRNA2组和shRNA3组与转染随机片段组比较差异有统计学意义，以shRNA3组下调最显着，并且VEGF蛋白水平也出现相应的下调；转染48 h后K562/A02细胞中MDR1，MRP1及topo的mRNA水平均出现不同程度下调，以shRNA3组下调最显着，分别下调，GST基因表达则无明显变化；阳性转染组细胞对多柔比星的敏感性明显增加，其中以shRNA3组最显着。结论： VEGF shRNA可以抑制K562/A02细胞VEGF基因与蛋白的表达，不同干扰片段的沉默效果不同，并增强K562/A02细胞对多柔比星的敏
3、感性，其机制可能与MDR1，MRP1及topo 的表达下调有一定的关系。【关键词】 血管内皮生长因子； RNA干扰； K562/A02细胞； 多药耐药 Abstract Objective: To study the relationship between vascular endothelial growth factor(VEGF) and multidrug resistance of human leukemia cell line K562/A02 by RNA interference, and then the mechanism was ： The VEGF shRNA ch
4、ain1,2 and 3 were designed,synthesized, then transfected into K562/A02 cells line by lipofectamine 2000 PCR was used to detect the expression of VEGF and MDRrelating genes MDR1,MRP1,topo,GST in mRNA level; Western blotting was used to analyzed the expression of VEGF in protein level; MTT was used to
5、 determine the IC50 of transfectional cells to doxorubicin. Results： Compared to K562 cell,the expression of VEGF in K562/A02 cell was even more(),and after VEGF shRNAs were transfected into K562/A02 cells,the expression of VEGF at the mRNA level were decreased,and there were statistical difference
6、between VEGF shRNA2 group or VEGF shRNA3 group and HK group(),the greatest decrease was seen in cells transfected with VEGF shRNA3;and the protein level of VEGF were also downregulated. The MDR1,MRP1,topo mRNA of K562/A02 cell were significantly decreased; the greatest decrease was seen in VEGF shRN
7、A3 group. The IC50 value of positively transfected group were lower than that of control groups. Conclusion： After silence of VEGF by shRNA,the mRNA expression of MDRassociated genes such as MDR1,MRP1 and topo in K562/A02 cells were downregulated,and the sensitivity of K562/A02 cell to doxorubicin w
8、ere increased. Key words vascular endothelial growth factor; RNA interference; K562/A02 cells; multidrug resistance 多药耐药目前仍是急性白血病治疗的主要障碍，尽管新的化疗药物和化疗方案不断涌现，但仍有部分患者因化疗耐药而导致治疗失败。白血病细胞的耐药往往同时存在数种耐药机制，MDR1，MRP1等耐药相关基因的高度表达是白血病产生多药耐药的主要原因之一。血管内皮细胞生长因子作为最重要的促血管生成因子之一，在肿瘤增殖、浸润和转移中起着重要作用。最近的研究表明1，在急性白血病初诊、缓解
9、、难治/复发各组骨髓及外周血中，VEGF水平均高于正常对照组，特别是在难治/复发性AL患者中，VEGF的表达水平最高，表明VEGF水平的变化和白血病病情、预后密切相关。因此，我们采用RNA干扰技术阻断白血病细胞株K562/A02细胞中VEGF的自分泌作用，观察细胞对药物敏感性的变化，并针对VEGF影响K562/A02细胞多药耐药的作用机理进行初步探讨。 1 材料与方法 材 料 转染试剂Lipofectin2000，Trizol试剂、胞核/胞质蛋白提取试剂盒、DAB显色试剂盒、RPMI1640培养液及无血清无抗生素OPTIMEMI培养液购自Invitrogen公司，RTPCR相关试剂购自Ferm
10、entas公司，VEGFA鼠单克隆抗体购自Ebioscience公司，VEGF shRNA1，2，3及通用阴性对照HK由武汉晶赛生物工程技术有限公司合成。人慢性粒细胞性白血病细胞系K562细胞购自中科院上海细胞库，K562/A02细胞购自南京凯基生物有限公司。 VEGF shRNA1，2，3的合成 以人VEGF mRNA序列(NM_001025366，NM_001025367，NM_001025368，NM_001025369，NM_001025370，NM_001033756、NM_003376)同源CDS序列设计shRNA双链，本研究选取的VEGF mRNA的靶位点分别是：shRNA1：5
11、GGCGTCGCACTGAAACTTT3，shRNA2：5GCGGATCAAACCTCACCAA3，shRNA3：5GTGAATGCAGACCAAAGAA3。 VEGF shRNA的转染 参照LipofectamineTM 2000 Reagent说明书，取停药2周的K562/A02细胞，无菌PBS洗1次，接种于培养瓶，每瓶接种细胞106，共设5组：分别为K562/A02、HK组、shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组，其中HK组和K562/A02为对照组，转染shRNA质粒的细胞为3个阳性转染组。配制A液： g shRNA溶于200 l RPMI1640培养液；配制B液：20 l L
12、ipofectamine溶于200 l RPMI1640培养液。将A，B两液混合，室温下静置30 min后加入待转染细胞中。37，5%CO2培养箱常规培养6 24 h，弃去培养液，换完全培养液继续培养。 RTPCR检测VEGF及相关基因的表达 于转染24 h，48 h后分别收获细胞，PBS洗涤3次，用Trizol Reagent提取总RNA，根据逆转录条件参照AMV酶说明书合成cDNA，取等量cDNA分别以各自引物测定各组细胞中相关基因actin，VEGF，MDR1，MRP1，topo，GST(引物序列见表1)的表达量，扩增产物在含 mg/L溴乙啶的%琼脂糖凝胶中电泳分离，于凝胶成像仪上扫描定
13、量，以actin作为内参照进行质控和标化。表1 相关基因PCR引物 蛋白质印迹法检测VEGF蛋白的表达 于转染48 h后收获细胞，PBS洗涤3次，按胞核/胞质蛋白提取试剂盒说明书提取胞质蛋白，行BCA蛋白制作标准曲线后定量，取50 g总蛋白加适量上样缓冲液100煮沸5 min变性，12%SDSPAGE电泳，1 mA/cm2恒流半干转膜，5%的脱脂奶粉室温摇床封闭1 h，以GAPDH作内参照，鼠抗人VEGF抗体，4过夜，洗涤液洗膜3次，10 min/次，山羊抗鼠二抗室温孵育1 h，洗膜同上，DAB显色，拍照。 MTT法检测细胞对多柔比星的IC50值 分别取转染24 h，48 h后的上述5组细胞各
14、以105/ml接种于96孔板上，2104/孔，各取4个复孔，加入不同浓度的多柔比星，培养48 h后加MTT 20 l/孔，37，5%CO2培养箱继续孵育46 h，弃去上清液，加DMSO 200 l/孔，振荡20 min，使紫色结晶溶解，在490 nm波长的酶标免疫测定仪上检测各组的光密度值，然后采用IC50值计算软件分别计算各组细胞的IC50值，相对逆转率=对照组IC50。实验重复4次。 统计分析 计量资料以均数标准差(s)表示，应用统计分析软件对实验数据进行统计学处理，两组资料比较采用t检验，为差异有统计学意义。 2 结 果 K562细胞和K562/A02细胞VEGF的差异性表达 PCR结果
15、发现：K562和K562/A02细胞中VEGF mRNA与actin的灰度比值分别为，差异有统计学意义，见图1a；蛋白质印迹结果也显示：以GAPDH为内参，K562/A02细胞VEGF蛋白表达明显高于K562细胞，见图1b。 shRNA转染后K562/A02细胞VEGF mRNA的表达 RTPCR分别检测转染24 h,48 h及72 h后5组细胞VEGF mRNA的表达，见图2。5组待测样本的cDNA均可扩增出强度基本一致的actin的特异性产物，可用于靶基因表达分析。转染shRNA后，K562/A02细胞中VEGF mRNA水平出现不同程度下调，其中shRNA2组和shRNA3组与HK组相比
16、差异均有统计学意义。转染24 h,48 h,72 h后shRNA3对VEGF mRNA的抑制率分别为%,%和%。 shRNA转染后K562/A02细胞VEGF蛋白的表达 蛋白质印迹法检测5组细胞VEGF蛋白的表达，可见40 kD左右有一条特异条带，为目的蛋白条带，以GAPDH为内参照，转染组与HK组比较，shRNA1组、shRNA2组VEGF蛋白表达量略有下降，shRNA3组VEGF蛋白表达明显下调。 shRNA转染后K562/A02细胞耐药相关基因的表达 见图4。5个待测样本的cDNA均可扩增出强度基本一致的actin的特异性产物，可用于靶基因表达分析。转染shRNA后的K562/A02细胞MDR1,MRP1,topo表达均出现不同程度下调，以shRNA3组下调最明显，与HK组相比，分别下调,
