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1、中药血清药理学研究方法探讨及思考黄峰 中药学 2110948107摘 要 中药及其复方药理学研究逐渐采用了血清药理学的方法，这成为一种新思路越来越被重视。本文就血清药理学的方法学探讨、问题等情况进行了综述，并在此基础上提出新的方法学思考及对其在中药和复方药理研究当中的应用前景做了展望。关键词 血清药理学；方法学；探讨；评价 中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用含有药物成分的血清进行体外实验的一种实验技术。于上个世纪80年代提出，由于其比较真实地反映中药的药效及其作用环境，并有助于中药复方化学成分研究及中药药动学研究的深入，目前越来越受到人们的重视
2、。血清药理学用于中药研究的整个思路方法过程，包括动物模型的选择、动物给药方案确定、确定采血时间、含药血清的预处理和保存等。学习血清药理学的研究方法，是运用其进行中药研究的基础，也有利于做进一步深入的学习探讨血清药理学，使其思路更加完善丰满，方法更加规范化。1 中药血清药理学研究方法探讨血清药理学方法的规范化研究关键是中药血清制备方案的规范化研究，包括供体(实验动物)的选择、给药方案(给药剂量、次数、天数)、含药血清采集时间，含药血清的预处理和保存。1.1 动物模型制备1.1.1 实验动物选择常用实验动物为小鼠、大鼠1，也可用兔、豚鼠2等,一般家兔和大鼠应为首选。不同种属的动物，血清成分不同，人
3、与动物血清更存在差异。陆慧晶3认为，选择动物时应尽量选与人类生物特性近似的物种，制备血清的动物应与获取离体器官、组织细胞的动物相一致，从而缩小或避免动物血清之间以及动物血清和人类血清之问在理化、生物等特性上的差异，提高实验结果的可靠性。1.1.2 离体组织(细胞)选择体外培养细胞的供体动物与含药血清的供体动物应同种属。因为实验是要在体外尽可能准确的再现在体实验时药物与机体相互作用的整个过程，所以应尽可能减少因动物种属差异而造成的免疫反应。因此，在体外培养实验中宜采用同种单一血清，既为细胞提供营养，又为药物载体，还避免了多种血清的干扰4。1.2 动物给药方案1.2.1 给药前禁食饮食可能影响中药
4、复方体内动力学和临床疗效。如食物对口服小柴胡汤者体内甘草甜素、甘草次酸和黄芩素等的吸收影响明显。因此应根据中药复方的功效特点、实验要求，决定给药前禁食与否，并拟订给药后采血时间。目前，给药前实验动物多禁食612h，不禁水5。1.2.2 给药途径一般在制备含药血清时，供体动物的给药途径应该与临床给药途径一致，以避免由于给药途径的不同带来结果的差异. 目前中药复方多用口服(灌胃)给药来制备含药血清，但其他给药途径亦可使药物进入血清。同时，由于中药新剂型不断产生，在实验中也可根据实际情况，尝试使用注射、粘膜、呼吸道等给药途径制备含药血清。1.2.3 给药剂量血清药理学很重要的一个问题是给药剂量的确定
5、，合适的给药剂量，对保证实验的成功很重要。给药剂量除了要跟临床用量尽可能相一致之外，还要考虑因含药血清加入反应体系后，浓度被稀释，使反应体系的浓度达不到在体条件下的药物浓度等问题，所以目前尚无统一的标准，主要还是要通过预实验来确定给药剂量。关于给药剂量的研究目前有一下方面：王力倩等6在研究苦参、仙鹤草的抗癌作用时发现，以参考公式(给药剂量=临床常用量动物等效面积系数培养基内血清稀释度)计算给药剂量，得到的含药血清对肿瘤细胞体外生长有抑制作用，而比此给药量少I倍含药的血清则无明显作用。李仪奎等7提出两种方法：一是增大给药剂量，即给药剂量=在体实验的给药剂量反应体系中被稀释倍数(同上述王力倩所提参
6、考公式)。然而，其不足之处是给药剂量与血药浓度并不是呈等比增加，况且受到灌胃药物浓度和体积的限制。二是按新药药理研究的技术要求设计剂量给药，将含药血清制成冷冻干燥粉，以冻干粉形式加人反应体系使其达到所需浓度。其优点是：根据需要提高体外反应体系中的含药浓度或形成等容，有利于血清的储藏保存。王宁生等8认为，给药剂量以整体模型动物的有效剂量8一l8倍为宜。1.2.4 给药次数与时间间隔关于给药次数与时间间隔的想法主要是根据药代动力学理论，以固定给药时间间隔，相同剂量多次重复给药后血药浓度达到稳态，并将在稳态下不同采血时间取得的含药血清进行实验，均表现较高而且相似的药理作用强度。而药代动力学理论用的最
7、多的是半衰期理论，即理想给药时间应按药物半衰期间隔给药，连续57个半衰期使血药浓度处于稳态。但是中药及其复方成分十分复杂，半衰期难以测定。目前常用的方法有：1次给药或间隔24小时给药，或1天13次，连续3l0天。单次给药较多次给药药理活性明显低，或单次给药制备的含药血清产生作用的给药剂量极大(临床等效剂量5倍以上)。如单次予桂枝汤水煎剂后1、2、3 h采集的含药血清及正常血清均有显著抑制副流感病毒I型致病变作用，且两者无显著差异，说明血清产生的药效不全是药物作用的结果，主要是正常血清本身含有的抗病毒成分所致。因此单次给药后l、2、3 h采血方式不能反映药物本身在体内的作用规律。每日1次连续3d
8、给药后采血的方式可反映药效产生的时间点，突出含药血清本身的作用，基本排除正常血清对实验结果的干扰，优于单次给药。孟李9就复方丹参血清对中性粒细胞释放活性氧的影响，探讨含药血清制备方法的实验，证实同一给药方案连续数日给药较1次给药有明显差异，主要与药物诱导机体产生内源性生物活性物质有关，主张多次给药. 此结论目前已成共识。目前国内很多学者提出每天给药3次，连续57天的给药法，认为与临床用药情况相合同时蓄积的血药浓度已近坪值。1.3 采血时间理想的采血时间应该在血药浓度的高峰期。蒙一纯10认为，根据实验动物消化生理特点和中药吸收转化特点确定取血时间范围是合理的。如大鼠一般l2小时可达血药浓度峰值，
9、此时血清即为含药血清；时间延长将有部分药物组分发生转化，成为药物代谢血清。一般采血时间多集中在末次给药后3Omin3小时间。由于中药复方给药后，不同药物达峰时间不同，故对于采血时间很难有一个统一标准。包金风等11认为应对不同时间分别采血进行预实验，将不同时间的含药血清进行比较后再确定采血时间，是最可靠和科学的方法。1.4 含药血清的处理和保存1.4.1含药血清的预处理目前含药血清在采集后多经过56，30min的灭活处理。张军平等12研究者认为血清灭活这一常规处理方法是必要的。既可灭活掉血清中的部分补体，减弱对培养细胞的非药物性影响，又符合减少微生物感染的常规细胞培养要求。通常有3种方法。丙酮法
10、：向血清内加入45倍量丙酮，混匀，于3O00 rmin离心，取上清液温水浴上蒸发，除去丙酮；乙醇法：向血清内加人45倍95乙醇，混匀，于3000rmin离心，取上清液温水浴上蒸发，除去乙醇； 加温法：56 水浴上放置30min。这3种方法主要去除了血清中的大部分蛋白质、糖及部分电解质，血清的正常生理活性基本丧失，容易突出血清中中药的作用。同时，从实验中可看到，灭活血清不易起泡沫，对实验干扰较小。赵万红等13认为，在对含药血清进行灭活时还要考虑两点：这3种处理方法并不能去掉血清的所有正常活性；有可能去掉或减弱血清中中药的作用,这些情况没有统一的解决办法。而徐海波等14却认为含药血清灭活后，药物在
11、体内继发性变化诱生的体内有效活性物质会减少或丧失生物活性，从而影响药理实验结果，与体内作用机制不一致。故含药血清在采集后如何处理方面的争议表明含药血清制备技术有待于进一步规范化。1.4.2 含药血清的添加方式、添加量及对照组的设立含药血清添加方式目前多选择采用同一种属动物。在药物添加方式上，刘成海等15提出，在体外培养实验中宜采用同一种单一血清，既为细胞提供营养，又为药物载体，还避免了多种血清的干扰。从实验设计的角度考虑血清药理学实验方法时，应控制好实验结果的真实性和可比性，基本原则是：一是研究含药血清的加入量来评价血清中药物的真实有效浓度；二是设立正常血清空白对照组来排除血清本身所含干扰性物
12、质对实验结果的影响。前面已经讨论过血清加入量，张玮函等16研究了当归补血汤及其含药血清对小鼠红系造血祖细胞克隆的影响。结果显示，等剂量的2组当归、黄芪，其含药血清与正常血清比分别为l：5和1：l，归芪1：5组促进CFU2E和BFU2E的增殖的作用要明显强于1：1组(PO01)严永杰等17 探讨了反应体系中含药血清的加人量对实验结果的影响。实验显示，当头风饮含药血清与富含血小板血浆。1.4.3 含药血清的保存药血清保存前后对比采集的血清中可能含有多种有效成分，如药物本身产生的有效成分及药物作用于机体后产生的内源性物质等。周明眉等18以含头风饮血清抗血小板释放52HT和阻滞内皮细胞钙通道作用为指标
13、，探讨了低温保存和血清灭活对含药血清的影响。研究发现含药血清经长期低温保存(一20，2个月)后药效显著降低(PO01)，提示含药血清在保存过程中其中药有效成分会发生分解等变化，致使药效成分含量显著降低，即使低温冷冻保存仍影响其药效。故进行血清药理学试验时宜使用新鲜灭活或保存时问较短的含药血清。2. 存在问题与研究的难点中药血清药理学起步较晚，现仍处于探索阶段，尚不可完全替代传统中药药理实验方法。血清成分复杂，不可控的影响因素多。直接导致实验结果重复性差； 不同种属、不同年龄的动物对药物吸收有一定差异，从而影响到血清中含药成分及其含量。因此，开展中药血清药理学研究有待于规范动物的种属和年龄；因给
14、药剂量、采血时间不同，血清中含药成分及其含量也不尽相同，故必须充分把握好给药剂量及采血时间；在药理研究方法方面主要还, 存在血浆药理方法和血清药理方法之争。贺石林19等认为应加强中药多层次半体内实验研究，其中血浆药理方法呵避免血清药理方法的弊病。葛金文20等认为血浆的组成较血清能更好地反映生理、病理状况和吸收进入循环血中药物变化; 含药血清在体外反应体系中，血清药物浓度被稀释问题，特别是中药复方制剂中微量成分及蛋白结合率较高的成分，给药物检测和药理实验提出了难题；含药血清制备：实验动物没有采用病理模型制备动物血清；血清时效、量效关系的确定有待于进一步探讨。没有考虑到空白血清本身的作用，因此没有
15、设立该对照组；含药血清对离体系统同样有干扰，如血清本身对体外酶活性的影响等.3 中药血清药理学研究方法的几点设想3.1 含药血浆与含药血清平行对比观察。若彼此间实验结果一致则可认为这种结论是可靠的。若含药血浆与含药血清的作用方向相反，则应以不同抗凝剂含药血浆再试，如疑似抗凝剂的影响，亦可向血清加入相同抗凝剂进行比较。中药血清药理学与血浆药理学方法得到的实验数值难以相等或相近，但引起变化的方向性应是一致的；只有取得共同性，这种结论才是可靠的.32 含药血清和中药粗制品协同研究 大多数试验表明，含药血清疗效较好，中药粗体物无效，也有相反的结论，还有两者均有作用。这表明中药血清和粗提物的作用是有区别
16、的，有的是中药原药起作用，有的经胃肠道消化吸收后起作用。如能协同研究，可以更好的发现中药发挥作用的物质基础，对于临床用药也更有指导意义。33 离体试验和在体试验并行离体实验条件易控制，可以排除体内干扰，但由于体内外的环境不同，体内外的细胞功能不完全相同。如果离体实验与在体实验相配合，能从深层次上阐明复方制剂的作用机制，并且能更好的与临床实验相符，从而增加实验设计的说服力。34 血清药理学、血清药化学、药物动力学同步迄今含药血清试验方法偏重于药效研究，没有对血清中有效成分作更深层次的分析，尚缺乏对血清中所含药物成分的定性、定量分析，其在体内的代谢过程也未知。若能以空白血清做对照，借助光谱图、色谱图等分析技术，对药物血清做综合技术评定，同时监测多种
