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1、子实体黑色素提取研究平菇中对形成色泽的物质提取纯化，及功能研究。目前国内外对平菇中的黑色素类物 质并没有做相关研究。广义的黑色素包括两大类，一类是Tyr,多酚及他们相关化合物代谢的终产物黑色素 melanin,这类黑色素是复杂黑色高聚物，又可分为三类：真黑素(eumelanin)、棕黑素 (phaeomelanin)和异黑素(allomelanin)。真黑素含氮原子，不含硫原子，颜色为深棕色 或黑色；棕黑素含氮原子和硫原子，颜色略带红色的棕色和黄色；异黑素呈棕色或黄色，主 要存在于植物中。另外一大类属于花色苷类黑色素，主要分布于植物中。关于真黑素的生物合成，目前认为酪氨酸酶CTYR)是它们形成
2、的关键酶，酪氨酸在酪氨酸 酶连续催化作用下氧化成多巴，再氧化成多巴醌，后者经环化进一步氧化成某些中间产物。 中间产物经重排和脱梭生成5,6一二轻基吲哚，后者再氧化生成相应的酮。吲哚-5,6-醌是形 成真黑色素的主要前体，它与上述一些中间产物聚合生成真黑色素，但真黑色素的结构尚不 完全清楚。需巴色素二殍基硼嗓图L2真黑素的形成过程棕黑色素的形成过程，由酪氨酸到多巴醌与真黑色素是一致的。但在多巴醌以后的反应中 有半胱氨酸(cysteine)参加，产生5-Cys 多巴和5-Cys-多巴醌，后者经环化、脱梭成为苯并 嚎嗦的衍生物，这种衍生物经过聚合生成分子量更大的棕黑色素。棕黑素的形成过程，见图 1.
3、3:可见，真黑素与棕黑素的主要区别就是在其合成过程中是否有半胱氨酸的参与，并且 半胱氨酸是唯一的参与棕黑色素合成的硫化物。半胱氨酸与多巴醌的加成速度远远大于多 巴醌分子内的环化速度，当半胱氨酸存在时，即使量非常小，反应也倾向于合成棕黑素 异黑素是在多酚氧化酶(polyphenol oxidase)存在下通过多酚氧化聚合而成的。第二类花色苷类黑色素是花色素与糖以糖昔键结合而成的一类化合物。现已查明，天 然花色昔配基的基本结构为 3, 5, 7一三轻基-2一苯基苯并吠喃，结构式为图1.4:OH图1.4花色普类黑色素的分子结构特征在花色素A环3,5,7位上的羟基以糖苷键与糖结合时便形成花色苷，由于糖
4、结合的方式 不同，如结合糖的种类、数量、位置的不同，花色苷的种类也不相同。1.4 天然黑色素的萃取方法 天然黑色素的萃取应根据不同原料所含色素性质的不同来选择，一般要求溶剂选择性强，即溶解色素的能力强，对其它杂质成分溶解力差。黑色素的萃取运用其溶于碱性溶液而 在酸性溶液中形成沉淀的性质;花色昔类黑色素的萃取运用其易溶于水、乙醇等溶剂的性质。 目前，对天然黑色素的萃取方法有水法、醇法和碱法三种。(1) 水法 水法简便，成本低，但选择性差，大量非色素杂质被萃取出，萃取出的色素色价较低， 萃取液质量不高。陈祖洪35用40-50倍水浸提风香树叶5-6次，时间约为24h，再经浓缩、 真空干燥后，即得黑色
5、素产品，得率为13%-15%。王国良36将樟木科树叶经粉碎后用60C -100C水浸泡2-6h后，过滤，滤液在60C低温真空下浓缩至浓度为30g/100g-50g/100g即得 产品。(2) 醇法 为了克服水法选择性差的缺点，一些研究人员对花色苷类黑色素采用酸性乙醇法萃 取。此法的优点是:花色昔类色素在酸性乙醇溶液中稳定，溶剂选择性高，萃取率也高，安 全可靠，常温下不易大量挥发，而又能在较低的加热温度下蒸发。缺点是萃取率低，产品成 本高。王新平等从黑糯米中萃取黑色素，用80%乙醇溶液作浸取剂，调节pH为2,在80 C恒温水浴锅中加热40min，然后过滤，真空浓缩，干燥。崔蕊静等研究结果表明，黑
6、 豆皮红色素最佳萃取工艺是：95%乙醇与O.1g/100g HCL按1:2混合作萃取剂，物料与萃取剂 比为1:40(wlv)，温度70C，浸提时间100min。其得率高于单纯用水或盐酸提取，且颜色亮 丽。孙玲等8 l认为，黑芝麻色素的最佳萃取条件是将黑芝麻粉碎后进行3h脱脂处理，浸提 溶剂为酸性醇溶液，浸提温度80C，浸提时间3d,物料比为1: 50(wlv)，在该条件下，黑芝 麻色素的萃取率可大于98.1%。但是，这个结果与黑芝麻色素在pH1-4不溶的性质不符，因 此需要进一步实验加以验证。(3) 碱法此法的优点是:溶剂对黑色素选择性高，溶解力强，萃取率高。周旭章3 提出利用氢氧化钠的水溶液
7、萃取黑芝麻色素的方法。在40 C、氢氧化钠的 浓度2-4g/100g时浸提:在pH值为2.7-2.0时沉淀分离。其得率在1.3%-1.4%范围内，色价为 E=153(340mm处)，萃取色素后得油率仍在60%左右。王恒山等37新鲜的桂花种子皮清洗 后剥下表皮，粉碎，称取340g放在锥形瓶中，以10g/100g NH3H2O溶液(pH=10.5 )为提取 液，桂花种子皮与提取液的配比为1:5(w/v)，在25C下静置保温36h,过滤分离,清液用2mo1/L HCL溶液调pH=2.5，使黑色素沉淀，室温静置12h，再过滤分离，即可得到桂花种子皮黑色 素粗品。赵肃清等37，将变黑了的香蕉皮内层软的部
8、分，置于浓盐酸中放置过夜，过滤， 取滤渣用1mol/L的热的氢氧化钠萃取，静置，离心，得黑色素粗品。1.5 天然黑色素的纯化方法粗制天然黑色素因为含有其它成分，直接影响到色素的稳定性、染色力及应用范围， 必须进一步加以分离纯化。分离纯化的方法主要是沉淀法和层析法，层析法包括纸层析、薄 层层析、柱层析，以及高效液相色谱法等。(1)碱溶酸沉法碱溶酸沉的方法不但可以萃取黑色素，而且可以纯化天然黑色素，酸的水解作用可以 去除与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物以及脂类物质。从毛发中萃取黑色素时，先用酸水解蛋白质，使黑色素从结合态转为游离态，并形成 沉淀，然后反复用氨水溶解和酸沉淀，得到较纯的黑色素37从香
9、蕉皮和黑芝麻皮中萃取黑色素，先是用10mo1/L的氢氧化钠浸提,然后用6 mo1/L HCL调pH到酸性使黑色素沉淀，反复3-5次即可得到纯的黑色素。赵肃清等18用此法纯 化香蕉皮黑色素，最后的沉淀用乙醇洗3 - 5次，真空干燥后的纯化后的香蕉皮黑色素。王恒山等36均等桂花种子皮黑色素粗品于100C条件下用1 mo1/L HCL溶液水解2h 过滤分离，再分别用三氯甲烷、乙酸乙酷、95%乙醇反复处理沉淀，每一次都用HCI调pH 2.5 得到沉淀，并用蒸馏水洗涤，即可得到纯化后黑色素的沉淀。(2) 纸层析法 纸层析是分离天然色素的一种较为传统的方法，具有快速，简便等优点缺点是制备量少。钟丽玉等11
10、采用三次纸层析法得到黑米黑色素的主要花色苷:矢车菊花色素-3-鼠李 糖苷和芍药花色素-3-阿拉伯糖苷等5种色素，三次的展开剂分别为BAW12h,正丁醇:2 moI/L 盐酸(1:1, V/V溶液中层析10h，水:醋酸(85:15 ,V/V ) , 15 X 30cm新华三号层析纸，上行法。(3) 柱层析法柱层析法的优点是制备量大，产品质量好，回收率高;缺点是操作复杂，分离时间长。张名位等12将提取得到的黑芝麻黑色素减压浓缩，过硅胶层析柱，用乙醇-三氯甲烷 -水(V/V/V,2065/15 )洗脱，收集紫红色洗脱液，经浓缩，得色素浸膏，经反复结晶和重结晶, 得色素粉末。经分析确定黑芝麻黑色素属于
11、黄酮类花色苷化合物，具有2-苯基-苯并呋喃环 结构。张晴等13用大孔吸附树脂纯化黑米黑色素，所得黑米色素中花色苷含量达23.7%， 色价E1cm!%=83,产品纯度远远高于现行的国家标准。张远志等16对板栗壳色素进行聚酰胺 柱层析分析，初步确定为二氢黄酮类化合物，并带有取代基团。1.6 黑色素的理化性质已有研究表明黑米13和黑大豆12色素是花色苷类黑色素，将它们的部分理化性质 与黑芝麻色素作比较，以考察三种色素稳定性的异同。黑米色素和黑大豆色素在pH值为2 -11条件下，色泽均表现出由红色到蓝紫色和橙 黄色的变化特征。黑米色素在pH值为4.0时，呈鲜红色，pH值为4-7时蓝色，pH值11时 色
12、素开环转变成茶尔酮结构，显橙黄色黑大豆色素在pH值为2-4时呈深红色，pH值为4-7 时显橙黄色， pH 值为 7-11 时蓝紫色12。黑芝麻色素在pH值为1-4时不溶，pH值为4-7时紫褐色，pH值为7-11时颜色变深 6,12。黑大豆和黑米色素对光的反应较为敏感，黑芝麻色素较稳定，对光的稳定程度:黑芝 麻色素黑米色素黑大豆色素12。80C以下，温度对三种色素的影响不大，高于80C则对 色素有较大影响，其顺序:黑大豆色素黑米色素黑芝麻色素。相对而言，黑芝麻色素对温 度的稳定性较强20。AI3+, Mg2+能提高三种色素的稳定性，且有一定的增色效果，并且随着 浓度的增加而增强，Fe3+对三种色
13、素有减色作用，添加后随着时间的延长，吸光值进一步下 降, K+, Na+则对三种色素的影响不明显21。从以上对比发现环境对黑芝麻黑色素的影响比花色昔类黑色素小，黑芝麻色素具有黑色素 M 的理化特征171.7 黑色素 M 功能性及应用黑色素M的光保护、营养和保健价值是引起人们对其关注的一个重要因素。黑色素 M 除含有普通色素的各种营养成分外，还有显著的光保护性、抗氧化还原性和干扰体内病 毒形成等生理活性，显示出它独特的作用。(1) 光吸收黑色素 M 多聚物有很多有趣的特性，其中最显著的是由于其高度的共轭效应而产生 的广谱吸收特性。这种色素显黑色是其吸收多数可见光的结果，甚至还吸收一些低能量的辐
14、射。可见光范围内的能量转移发生在非键轨道到反键轨道的跃迁中，而黑色素M中有很多 C=0键。黑色素M吸收紫外区域的光，能量从成键轨道到反键轨道转移，主要发生在不饱 和的碳键中。由于共扼的电子离域效应，使得这种由成键轨道到反键轨道的跃迁更加便利。 随着共扼程度的增加，吸收只需要更低的能量，一般称之为红移现象。多数由黑色素M吸 收的可见光能量通过光子一声子结合转化为热。含吲哚醌较多的黑色素M(如真黑素)之所以 会显得黑一些，主要是由于其在光谱红色部分有很强的吸收，这些低频率的光的吸收主要是 通过碳基，而一些含较少碳基的黑色素M(如褐色素)，会显得较黄或较红。其中，最著名的 就是鸡羽毛上的红黑色素，它
15、含有多量的硫38。(2) 氧化还原性黑色素M,尤其是真黑色素，表现出显著的氧化还原性，并且由于在醌和多聚物邻 苯二酚部分之间的电子离域，使其产生很多半醌自由基。黑色素M可以参与一些单价或双 价的氧化还原反应，光吸收的结果使这种色素产生光氧化，使其所含碳基数增加，从而改变 黑色素 M 的吸收特性，即所谓即刻色素变黑反应。黑色素 M 的抗氧化性还表现在具有很强的阳离子鳌合特性，主要是通过羧基和轻基 这些阴离子起作用的38(3) 其它作用黑色素M前体-儿茶酚、5,6-二经基叫睬、1,8-二羟基萘是广谱抗生素，可以干扰HIV 诱导的合胞体的形成，阻止HIV-1膜表面的糖蛋白和T细胞特异单抗与淋巴母细胞
16、的结合39 (4)黑色素 M 的应用黑色素M具有抗日光、紫外线、X射线、r射线、宇宙射线、核辐射等多种辐射的作 用，因此，它具有保护体内细胞免受辐射损伤的功能，即黑色素M的光保护作用。黑色素 M 的这一性质可用于外表修饰，目前已被广泛应用于生产防晒霜、洗发剂、染发剂和各类 防辐射眼镜等。另外，黑色素M在作为半导体和生物杀虫剂的光保护剂等方面也有着广泛 的应用前景。Malgorzata等39认为黑色素M除赋予生物体某些特殊防御作用外，它的抗氧化的功 能表现在能阻止心磷脂脂质体的氧化。Eric.S.J.等41 认为真菌黑色素还可抵抗高锰酸钾、次 氯酸钾盐及其他氧化物的氧化作用。黑色素M作为新型的天然的药物载体，用来治疗某些 与黑色素 M 缺
