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1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法 一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四瞠光化还原法）1、试剂得配制（1）0、05mol/L 磷酸缓冲液（PBS,pH7、8）:A母液:0、2mol/L磷酸氢二钠溶液：取NaHPO- 12HO （分子量358、14）71.7g;242B母液:0、2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaLPOQHO分子量156、01） 31.2g。分别用蒸馅水左容到1000ml。0、05mol/L PBS （pH7、8）得配制：分别取 A 母液（NaHPO） 228, 75ml,B 母液（NaHPO）242421、25ml,用蒸餾水左容至lOOOmL 1 1佟PVP
2、 （宗W毗.；.丨参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术、髙等教育出版社,2000:267 268。（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1、39典Met用磷酸缓冲液（pH7、8）定容至lOOmL网 h说定容到100ML我也不懂。拜托（3）10011mol/L EDTA-Na：冷 m（） 3721g EDTANw .000ml；（4）100hM核黄素溶液:取0、0075g核黄素 用 ：定容至100ml,避光保存，门汀汁.丨稀释10倍（5）750 i* mol/L気伽喙NBT）溶液霹取O.O6133g NBT川缓冲液定容至UJOml避光 保 存；酶液制备:収 定沈叶Mi物叶川视禹耍从
3、丿；门脉）（）巡J厲冷彳抑：.2ml磷內冲液在 冰浴卜研磨成浆，加缓冲液使终体枳为10ml.取5ml于10000r/min 1、离心lOmin. hin液即 为SOD粗提液。提取酶液时如何保存;如果没有测完得需要放在4匸得冰卷叽2、酶活性测定2. 显色反应取试管（要求透明度好）5支,3支为样品测左管,1支为对照管，另外1支作 为 空白，按表39-1加入各溶液。混匀后将空白管置暗处，其它各管于40001X H光灯下反应20min （要求各管受光情况一致, 反应室得温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。表39-1各溶液加入量试剂（酶）用量（ml） 终浓度（比色时）0 05mol/L 磷
4、酸缓冲液 130mmol/LMet 溶液 750 u mol/L NBT 溶液 lOOumol/LEDTA-Na 液220 u mol/L核黄素酶液蒸懈水总体 积加垓黄素时记得耍快并且要避光，SOD活性测定与讣算 至反应结束后，以 不照光得作空白分别测宦氏它齐耸560nm波1、513mmol0、375 u mol0、310 u mol0、32、0 u mol0、3空白与对照管加缓冲液代替0、05酶液0、253、0长卜得消光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原得50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性:SOD总活性二式中SOD总活性以每克鲜重网单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋
5、白表示:A。一照光对照管得消光度值;As-样品管得消光度值;Vt样液总体积(ml);Vl测定时样品用FW样重(g):蛋白质浓度单位为毎克鲜重含蛋白亳克数(mg/g)o用荧光灯20v照20min可以吗 不可以.二、POD、CAT酶活性得测定粗酶液制备同SOD.1、过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法)(1) 试剂配制：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6、0):分别取A母液(NaHPO)6k 5ml与B母液(NafhPOJ24438、5ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M,pH6. 0);(2) 反应混合液配制：取50ml PBS(100mmM,pH6、0),加入28ul愈创木酚(
6、2冲氧基酚)加热搅拌溶解，冷却后加入19ul 30%得H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。(3) 样品测定:称取lg.放入预冷研禅，加适駅磷酸缓冲液研烧至匀浆以4000r/min离心15min.上淸液转 入100ml容量瓶用磷酸缓冲液宦容至刻度贮于冷处备用。取试管3支,一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液lml作调零，两支取3ml反应液并加入I ml it 即计时，在470nm测定，酶隔30s读书一次个样加个，不要全部加上 边 加样 边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢得话要保证毎个样品从加好样到开始记时得吋间相差不大)(4) 酶活性计算：以每min OD值变化(升高)0、01为1个酶活性单位
7、(u)。POD=(AA470xVt)/(WxVsxO. Olxt) (u/g min)AA470:为反应时间内吸光度得变化;W为样品鲜重(g); t为反应时间(min):Vt为提取酶液 总体积;Vs为测定时取用酶液体积。2、过氧化氢酶(CAT)活性测定(1) 试剂配制：()、mol/L 磷酸缓冲液(pH7、0):取 A 母液(NauHPCU) 61、0 ml 与 B 母液(NaHiPOQ 39、0 ml混合后至lOOmL (加lgPVP)(2) 反应液配制：5、68ml 30%得H0 (原液)l()()()ml.摇匀即可。22(3) 样品测定:1、酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5
8、g置研钵中，加入2 3ml4C下.pH7、0磷酸缓冲 液与少量仃二i研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗 液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶苣4( r 10min.取上部澄淸液在4000rpm im5min, 上淸液即为过氧化氢酶粗提液4C下保存备用、2、测定:取10ml试管3支，其中2支为样品测定管,1支为空白管(II 7 M任沁，中5-10min, 冷却之后加入H2O2测定吸光值)，按表40-2顺序加入试剂。表40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表子号粗酶液(ml)pH7、8 磷酸(ml)蒸餾水(ml)S10、21、5仁0S20、21、5仁0S30、2K
9、5仁025(预热后，逐管加入0、3ml 0. 1 mol/L得H202，每加完一管立即记时，并迅速倒入石 英比色杯中，240nm下测泄吸光度，每隔1min读数1次，共测4min,待3支管全部测尼完后， 按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液(pH=7、8)3、结果计算：以1 min内A240减少0、1得酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶活性(u/g/min)二 A240xVt/0、lXVlXtXFW 式中 A240 = ASO- (AS1 +AS2)/2ASO-加入煮死酶液得对照管吸光值；AS1, AS2样品管吸光值；Vt粗酶提取液总体积(ml);V1测定用粗酶液体积(ml);FW样品鲜重(g)
10、;0、1A240每下降0、1为1个酶活单位(u)；t加过氧化氢到最后一次读数时间(min)五、丙二醛含量得测定1、试剂配制：10%TCA:100g 三氯乙酸-* 1L0、6%TBA:0. 6g硫代巴比妥酸，加少化钠(lmol/1)溶解-用10%TCA定容100ml (避 光)lmol/1氮氧化钠;称1吓aOH用蒸憎水溶解宦容100ml3、测定步骤：称取剪碎得试材lg,加入2ml 10%TCA与少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研空，匀浆离心(4000r)离心lOmin，匕淸液为样品提取液。3、显色反应与测疋 吸取离心得上诸液2ml(对照加2ml蒸饰水)，加入2ml 0、6%TBA
11、溶 液,混匀物于沸水浴上反J 15min,迅速冷却后再离心。取I：淸液测定532nm、600nm 1 j 450nm波长F得消光度。(2)双组分分光光度法 按公式可直接求得植物样品提取液中MDA得浓度。用上述任一方法求得MDA得浓度，根据植物组织得重虽:计算测左样品中MDA得含量： MDA( umol/g FW)=C2(umol/U=6、45*(D532D600)-0、56*D450G为MDA得浓度；D)o、D 、Dmo分别代表450nm、532nm 1 j 600nm波长下得消光度值。iS；七 可溶性蛋白含屋得测定(考马斯亮蓝染色法)1、试剂得配制(1)考马斯亮蓝溶液配制:称取()、001,
12、_考马斯亮蓝，溶于50 ml 90%乙醇中，加入100 ml 85% (W/V)得磷酸(不懂).:II 100ml川J再用蒸懈水泄容到1 L,贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放巻1个月。(2)100画ml牛血淸蛋白(BSA)标准溶液:称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml.再从 中 吸取40ml用蒸餾水左容至100 ml(也可取10mg BSA龙容至100ml即为lOOpgml标准BSA溶 液)。2、样品可溶性蛋白含呈得测定(1)样品叮溶性蛋白含城测迄称取鲜样0、5缶用5ml蒸懈水或磷酸缓冲液研懈提取吸取样 品 提取液1、0MI,放入貝塞试行中(毎个样品设直两个重复)，加入5MI考4斯亮蓝G 250溶 液， 充分混合，放置2Min后在595nM I：比色，记录吸光值，并通过标准曲线低得蛋口质含量。调 零管就是用蒸懦水样品中蛋白质得含虽：(Mg / g)二CxVT/(Vl xFWx 1000)(2-2) 式中C:查标准曲线值(pg) ； VT:提取液总体枳(Ml);FW:样品鲜重(g); VI:测定时加样量(Ml)。我就测这五个所以帮下我谢谢。
