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1、半定量RT-PCR小结（一） 试验原理 半定量PCR是用于确定目的基因mRNA表达的量，通常以一个管家基因作为参照，传统的方法是将RNA逆转录获得cDNA，然后使用等量的cDNA作为PCR模板，用特异引物进行扩增得到目的基因和管家基因的片段，由于不同组织或细胞等来源的目的基因表达量不同，在同一个PCR体系条件下扩增得到的产物不同，而管家基因的表达则相同（理论上，实际可能在不同组织，细胞周期或者外界因素如药物处理后也会有差异），然后使用灰度扫描软件（如Totallab或Bandscan）对目的基因的扩增条带进行灰度扫描，得到各条带的灰度，经过内参矫正后，得到一个相对值。 用凝胶成像系统自带的分析
2、软件分析目的条带和内参照的平均密度值，也称为灰度值。用目的条带的平均密度值除以内参照的平均密度值，即所需要的RATIO，看density 与area 的乘积。 而两个基因可以进行同管扩增，有时无法同管扩增，则分管扩增。 同一次实验中，这个相对值理论上与其对应RNA的量成正比。这个方法是比较粗糙的，结果也受多方面的影响，可信度并不高。如果有条件的话建议做Northern blot 或 Realtime PCR。 首先要保证PCR过程处在它对数期，第二要保证每管扩增的效率相同，第三电泳点样、凝胶成像的分辨率等等。 与经典的检测基因的表达方法如Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及
3、S1 核酸酶分析等相比,半定量RT-PCR 法具有灵敏度高(比杂交法高1 00010 000 倍) 、专一性好、快速简便、所需样品量少及耗费较低等诸多优点。然而,已有的研究表明,由于用半定量RT-PCR 法分析基因表达水平的影响因素较多 ,导致该法目前只能用于粗略比较样品间的基因表达水平。（二） 试验步骤总RNA抽提 总RNA提取时，根据大鼠发育时期及总RNA量，研磨小脑组织加入适量Sol D；总RNA沉淀过夜后，用适量Sol D重悬并加入等体积异丙醇保存于-80度；模板cDNA制备 取出总RNA用于制备cDNA时，可以根据EP管内沉淀量判断总RNA量的多寡，视反应需要沉淀适合体积总RNA，如
4、果沉淀量较多，一般吸取100 ul其内即含数ug 总RNA即可进行一两个反转录反应；多余的总RNA重悬加入适量Sol D重悬并加入等体积异丙醇保存于-80度；注：RT反应体系为Takara公司推荐体系，本次RT-PCR试验中，由于天气热/冰箱有点问题、试剂盒用了许久，造成其中的dNTP、酶、oligoDT降解严重，以至于严重地影响试验进行；王老师让我将dNTP、酶、oligoDT的反应量均增加为原来的1.5倍；这样使总RNA能更充分地用于反转录为cDNA。 以上均见分子克隆试验小结半定量RT-PCR15 ul PCR反应的体系下所示: 模板 O.2-0.4L 94 5min变性后在冰上急冷 1
5、0PCR buffer（含MgCl2） 1.5L dNTP Mixture 1.2L 引物1（10uM） O.6L引物2（10uM） O.6LTaq 酶 0.1LQ H20 11LPCR反应条件如下所示： 94 2 min 94 30s 56-58 30s 72 60s 24-30个循环 72 5 min 4 引物设计及选择引物的位置：有两种方法，一种是上下游引物设计在跨内含子的一个外显子的5端和下一个外显子的3端，这样不会在基因组上扩出来。第二种，设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和cDNA上得到得不一样，以上原则对单外显子基因不使用，这是最好选择DNAaseI处理。引物的长度：一般引
6、物设计为严格配对17-19 bp，最后一个碱基为G或C，且严格配对；GC含量为40%-60%之间，这样，所以基因包括管家基因与目的基因的退火温度基本一致，如果模板量一致，可以一次处理多个基因； 引物扩增片段长度：一般设计为350 bp-600 bp 之间；一方面可以避免cDNA二级结构对PCR造成的影响，同时，该长度电泳条带比较美观。引物设计好以后，最好在查一下有没有同源序列，尤其是一个家族的基因。内参的选择为避免RNA 抽提、加样、测量、cDNA 合成及PCR 反应过程中的某些系统误差和人为误差,用半定量RT-PCR 分析基因mRNA 相对表达水平时必须要引入内对照系统即内参。内参一般为管家
7、基因管家基因表达水平受环境因素影响较小,而且在个体各个生长阶段的大多数,或几乎全部组织中持续表达,或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响,而不受其他机制调节。传统的半定量RT-PCR 技术多以-actin 作内参;另外,常用的内参照还有GAPDH、-MG、18S rRNA 等。不同的生物体其生命过程和生理过程各不相同,选用何种内参要根据目的基因和实验的具体情况而定。为保证实验结果的可信度,每一次实验都必须做内参。我们研究的大鼠小脑基因的半定量RT-PCR，参照文献选取GAP43为内参。同管扩增或异管扩增的选择利用半定量RT-PCR 技术对mRNA 进行检测时一般
8、要将内参基因和目的基因在同管中或异管中进行扩增。同管扩增是指内参基因和目的基因在同一个管内进行扩增。异管扩增是指将二者分开来扩增。同管扩增可以保证目的基因和内参基因的反应条件完全一样,与异管扩增相比较,具有样品间的可比性强、系统误差小、操作方便等优点。但PCR 扩增存在平台效应,内参基因表达水平往往很高,目的基因的表达水平相对较低。在进行PCR 扩增时,常常是目的基因还在线性期,内参基因已经达到平台期。这样在进行同管扩增时,目的基因就会由于内参基因的竞争而受到抑制,从而降低扩增效率并最终影响结果的分析。与同管扩增相比较,异管扩增具有保证每个基因的扩增进程优化的优点,但又存在扩增效率不能保证一致
9、的缺点。因此,在实验中研究者要根据实际情况和需要进行选择。我们在实际的试验中，选择异管扩增。PCR 循环数的确定PCR 扩增反应是酶促反应,遵循酶促动力学原理,开始的循环内扩增产物呈指数累积,产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR 技术正是利用产物与模板量的这一线性关系,通过扩增产物来对比总RNA 中目的基因的表达 。但经过一定的循环后,PCR 产物不再呈指数累积而进入平台期,即产物的浓度不再增加。PCR 反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA 的含量和扩增效率。起始模板量越多到达平台期的时间就越短,扩增效率越高到达平台期的时间也越短。如果在平台期继续扩增,则低水平表达的目
10、的RNA 可能会增加,并与高水平表达的目的RNA 浓度相近。这样就掩盖了它们之间本来存在的丰度差异。因此,选择合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见和定量,也可使扩增反应在到达平台期前的线性范围内进行。故,为避免平台效应的影响,合适的循环数是PCR 半定量方法的关键因素之一 。方法一：一般来说,摸好管家基因的条件后，目的基因可以先分别做25、27、28 、29及30个循环,当看到条带逐渐变亮后,我们选用中间亮度做为最后循环数。实验中可以根据目的基因的表达强弱,适当增加或减少循环次数。方法二（可以节约模板）：任选两个模板量多的时期，15 ul的反应体系，可以先反应到27循环，然后取5
11、 ul样品处理、进行到28循环再取5ul处理，最后5 ul进行29个循环，三者一起电泳，观察后一个循环是否为前一个循环的二倍，及其条带亮度是否合适，根据以上来调整循环数，如果条带仍然不亮，则需要增加模板量。一般目的基因很少超过30循环，著名的actin很少超过25循环，如果你看到有人用actin和 GAPDH超过2830循环的话，结果是不可信的，实际上即使超过25循环也是值得商榷的，肯定在RNA或者cDNA的步骤有问题，此时因该增加模板量，而不是增加循环数，即使目的基因要用30以上也要考虑一下。对于想脾脏这样的组织，actin甚至可能要低于20循环，实际上在后文谈到的凝胶成像仪的检测范围之内，
12、应该循环数越少越好。还是那句话，并不是在指数期就可以的。 平台效应：PCR扩增能力是是否惊人的，理论上PCR合成产物（短片段产物）的数量经过每轮循环都将扩增一倍，应按2n-2n的指数方式递增，PCR反应30轮循环后，PCR扩增量应达到230个拷贝，约109个拷贝，但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片段的序列及反应系统的条件等多种因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106-107个拷贝。PCR反应中，当引物-模板与聚合酶达到一定比值时，聚合酶催化的反应趋于饱和，出现“平台效应”。平台效应出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。因为一般3
13、0循环为PCR反应的极限，故一般目的基因PCR不能超过30循环，如果条带仍不亮，需要增加模板量；二管家基因一般含量较丰富，故一般极限为25循环，否则，该模板条件下，许多目的基因就不能扩增出条带了。提示：跑电泳时不是很亮并不代表没有到平台期，参考定量PCR的图就明白了，有些基因的平台期是达不到很高的，要看你摸的时候不同循环的扩增产物的量之间的关系，在相邻之间的差异基本复合线性增长才是线性期。具体注意事项：（1）具体操作一般设置反应体系为15 ul；内参循环数为23C、24C、25C；为保证试验可靠性，摸条件一般设置两个备份；加样顺序为：先准备PCR管，管内加入水，混匀的模板，混匀、稍离心，94度
14、5 min，冰上急冷，依次加入buffer、dNTP，用枪头混匀、稍离心，加入酶，此时不再离心，分装，分装时注意比理论体积稍微少点，这样保证每个管中反应体积一致，分别加入引物；取酶时，枪头伸入酶管底部，竖直取出，这样才能使枪头残余酶较少，即使残余也得保证一致；每一个时期的PCR混合物必须由同一管混匀一致，分装后引物单独加，这样才能保证与内参的可比较性。上样加入 5 ul 6 X 上样 buffer，混匀；取10 ul上样电泳，上样时枪头稍伸入液面下，从一侧打出样品，使之成凹形运动，路程较远，至枪头吐出“小鱼泡”取出枪头，这样可以减少样品上浮；电泳配胶1%为基准，见难分开的非特异条带可提高退火温
15、度及稍微增加凝胶浓度；配置梳子取较小的那种，即上样孔为十七个，该种上样孔电泳后拍照视觉效果较好；调整管家基因cDNA模板基本一致，尽量保持在24C比较合适。当遇到较强的非特异条带时，需要适当增加退火温度，增加退火温度增强了特异性，故PCR产物的量不一定减少，可能还会增加。根据管家基因模板，摸索目的基因循环数，操作如前所述。每次试验必须同一PCR仪扩增、必须由内参做对照；正式试验必须三个备份；由于内参、目的基因及其之间循环数不一致，中间取出PCR管时必须按时取出，其后继续PCR；不同PCR仪其设置不一样，如东盛PCR仪显示28循环即总共28循环，而Bio-rad及Eppendof PCR仪显示28循环实为29循环（2） 视目的基因个数及模板消耗量，提前准备好和适量cDNA样品，并分装，保存于-80度，这
