葡萄灰霉病生物学特性研究白晓蒙生命科技学院 植物保护0802班指导教师：齐慧霞摘要：为进一步了解葡萄灰霉病的发病规律, 对其病原菌生物学特性进行了系统的研究结果表白:葡萄灰霉病菌生长的最适宜温度是20℃～25℃，在各种营养条件的培养基上均能生长，其中最适宜的是在以蔗糖为碳源的培养基和以硝酸钾为氮源的培养基最适宜于灰霉菌丝生长的固体培养基是胁本哲式培养基，最适宜的液体培养基是PDA培养基，光照对菌丝生长也有一定的影响，连续黑暗最适宜于菌丝的生长分生孢子的致死温度是58℃ ， 5min关键字：葡萄灰霉；生物学特性；分生孢子灰霉病是由灰霉菌(B otry tis cinerea) 引起的一种世界性的重要病害, 能危害蕃茄、草莓、黄瓜、葡萄等多种植物, 引起果实蔬菜腐烂, 损失比较严[1 2]1999 年张继民[3]对灰葡萄孢菌的生理和形态特性进行了研究; 但对灰霉病菌的生物学特性缺少系统的报道.本实验汲取前人的经验, 在培养基、温度和孢子萌发的实验范围上更加广泛, 实验更加系统实验与前人多数结果一致, 以期为此后葡萄灰霉病的发生与防治提供更为可靠的参考依据 1 1材料与方法1.1 材料 供试菌株：2023年10月从秦皇岛市昌黎县中粮集团华夏葡萄酿酒公司的葡萄基地上采集带有灰霉病菌的果实，通过组织分离，单孢纯化[4]，镜检观测分生孢子和分生孢子梗的形态，经鉴定[5﹑6]属于Botryis cinerea .，将纯化的病原菌转入PDA试管斜面中保存备用。
A: 分生孢子梗 B：分生孢子 C：菌核1.2 病原菌生物学特性研究1.2.1 温度对菌丝生长的影响在马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）平板中央接入菌龄相同的直径为0.04cm的菌饼, 每皿1 片, 分别别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下的恒温培养箱中培养[7]每解决3皿，3次反复，用十字交叉法逐日测量菌落直径并记录[8]1.2.2 温度对病原菌分生孢子萌发的影响 将病原菌在PDA平板培养基上培养7天，刮取其上的菌落，用无菌水配成孢子悬浮液，用纱布过滤得到分生孢子液，3000r/min离心10min，用灭菌的蒸馏水将分生孢子稀释至10×40视野下100个孢子左右备用用载玻片萌发法：培养皿中放一张滤纸（滤纸上打两个孔），上面放一个载玻片，用干热灭菌使用时，在载玻片上加两滴孢子悬浮液，位置在滤纸孔上方，培养皿中加适量的水，润湿滤纸，并除去玻片下滤纸空隙处的气泡，将培养皿置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下进行培养，每解决3皿，3次反复，24小时后检查分生孢子的萌发率1.2.3 分生孢子致死温度的测定取10ml孢子悬浮液（400倍镜下50～100个孢子/视野）于灭菌试管中，分别于40℃、45℃、50℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃不同温度解决5 、10分钟后，接种到培养基上，4d后观测菌落生长状况，以不产生菌落为致死温度。
1.2.4光照对病原菌菌丝生长及分生孢子萌发的影响在PDA平板上移入直径4mm的菌苔，在25℃下分别置于连续光照，12h光暗交替，完全黑暗3组光照条件下培养，用十字交叉法逐日测量菌落直径，每解决3皿，将滴有分生孢子悬浮液的载玻片置于3组光照解决下保湿培养24小时后镜检其萌发率1.2.5不同固体培养基对病菌菌丝生长的影响将直径为5mm的病菌菌饼接种到燕麦片、玉米粒、PDA、PSA ，胁本哲式、大米汁、Czapek7种固体培养基上，置25℃恒温光照条件下培养， 用十字交叉法逐日测量菌落直径，每解决三皿1.2.6不同液体培养基对病菌菌丝生长的影响配制Czapek、小麦汁、胁本哲氏、PDA、PSA、大米汁和燕麦片7种液体培养基，各取100mL于体积为250mL的三角瓶内，每瓶接入两块直径5mm的病菌菌饼，置于摇床上28℃、120 r/min振荡培养，7天后测量产孢量和菌丝干重1.2.7不同营养条件对病菌生长和产孢、孢子萌发的影响Richard培养基为基础培养基，以30 g蔗糖的含碳量为标准，分别用相同含碳量的葡萄糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉替换蔗糖，配制成具有不同碳源的培养基以10 g硝酸钾的含氮量为标准，以分子量计算，分别用相同含氮量的硝酸铵、硫酸铵、尿素、蛋白胨替换硝酸钾，配制成具有不同氮源的培养基。
2 结果与分析2.1 不同条件对病原菌菌丝生长的影响2.1.1不同温度对菌丝生长的影响表1不同温度对菌丝生长的影响 温度（℃）菌丝生长直径（cm）1d2d3d4d5d6d7d50.400.400.40.751.272.703.12100.400.401.1832.834.827.208.08150.621.672.773.675.006.627.62200.652.673.857.358.128.408.40250.983.9276.277.778.408.408.40300.591.562.653.754.766.678.35由表1可知灰霉病菌在5～30℃的范围内均可生长，5～10℃范围内菌丝生长缓慢，最适宜菌丝生长的温度是20～25℃，在第5d和第六天即达成到满皿，显著高于其他温度，35℃以上的温度条件下菌丝停止生长说明，灰霉病菌中、低温环境较适宜其生长发病2.12不同营养条件对病菌生长的影响表2不同碳源培养基对菌丝生长的影响碳源菌丝生长直径（cm）1d2d3d4d5d6d7d蔗 糖0.931.884.767.838.408.408.40乳 糖0.851.133.305.328.408.408.40葡萄糖0.771.282.804.777.028.408.40麦芽糖0.901.273.175.037.107.478.40可溶性淀粉0.771.121.953.856.207.578.40表3不同碳源菌丝生长的差异碳源3d菌落直径P0.05P0.014d菌落直径P0.05P0.01蔗 糖4.76aA7.83aA乳 糖3.30bB5.32bB葡萄糖2.80bB4.77bcBC麦芽糖3.17cC5.03cC可溶性淀粉1.95dD3.85dD由2、3表可知葡萄灰霉在各种碳源的培养基上均能生长，在第7天时均达成满皿状态，但不同碳源培养基生长速度有所差异，在乳糖和葡萄糖为碳源的培养基上第3d时的菌落直径之间无显著差异但与其他碳源之间存在极显著差异，在第4d时在以麦芽糖为碳源的培养基上菌落生长加快与葡萄糖、乳糖之间无显著差异，与其他三种碳源的培养基仍然达成极显著差异的水平，因此不同碳源培养基菌丝生长的顺序依次又大到小依次是蔗糖>乳糖>葡萄糖>麦芽糖>可溶性淀粉。
表4不同氮源培养基对菌丝生长的影响氮源菌丝生长直径（cm）1d2d3d4d5d6d7d尿素0.831.422.234.044.705.325.42硝酸铵0.831.734.325.877.358.408.40硫酸铵0.751.774.085.737.328.408.40硝酸钾0.931.884.767.838.408.408.40蛋白胨0.902.155.678.058.408.408.40表5不同碳源菌丝生长的差异碳源3d菌落直径P0.05P0.014d菌落直径P0.05P0.01尿素2.23aA4.04aA硝酸铵4.32bB5.87aA硫酸铵4.08bcBC5.73bB硝酸钾4.76cC7.83bB蛋白胨5.67dD8.05cC由表4可知以硝酸钾和蛋白胨为氮源的培养基最适宜于灰霉菌落的生长，均在第五天就达满皿，由表5可知葡萄灰霉菌种在不同碳源培养基上的生长速度之间存在差异，第3d时以硝酸铵和以硫酸铵为氮源的培养基之间无显著差异，硫酸铵和硝酸钾之间亦无显著差异但与其他氮源之间存在显著差异，在4d时以尿素为氮源的培养基上菌落生长加快与以硝酸铵为氮源的培养基之间无显著差异，综合以上情况可知在不同氮源培养基菌丝生长的顺序依次又大到小依次是硝酸钾>蛋白胨>硝酸铵>硫酸铵>尿素表6不同培养基对菌丝生长的影响不同培养基菌丝生长直径（cm）1d2d3d4d5d6d7dPSA0.873.335.797.138.408.408.40PDA0.983.606.327.438.408.408.40cazpek0.403.224.235.086.907.588.40大米汁0.801.953.154.938.408.408.40燕麦片0.921.802.903.975.126.187.98玉米汁0.401.483.775.987.328.238.40胁本哲式0.401.676.958.408.408.408.40表7不同固体培养基菌丝生长的差异 不同培养基3d菌落直径P0.05P0.014d菌落直径P0.05P0.01PSA5.79aA7.13aAPDA6.32bB7.43bBcazpek4.23cB5.08bB大米汁3.15dC4.93cC燕麦片2.90eC3.97dD玉米汁3.77fD5.98dD胁本哲式6.95fD8.40eE由表6可知最适宜灰霉菌丝生长的培养基是胁本哲式培养基，其前期生长缓慢在第三天时生长速度加快，菌落直径明显大于其它各个培养基，在第四天即达成满皿状态。
另一方面是PDA、PSA和大米汁培养基较适宜于菌落生长均在第五天达成满皿状态玉米汁、cazpek均在第七天时达成满皿，最不适宜于灰美菌落生长的是燕麦片培养基2.1.3 光照对病原菌菌丝生长的影响 表8不同光照对菌丝生长的影响不同解决不同光照对菌丝生长的影响1d2d3d4d5d6d连续黑暗0.722.083.734.986.407.10光暗交替0.954.257.428.408.408.40连续光照1.534.338.228.408.408.40由表8可知在连续黑暗、光暗交替、连续光照三个解决下，连续光照最适宜于菌丝的生长在第三天就达成满皿状态，另一方面是光暗。