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1、一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，20冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，20避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法： 1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，
2、75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀
3、释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95以上)。调整细胞浓度为5105/ml。 梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。注：一般68周龄小鼠，根据品系不同，可得520107细胞/只小鼠；手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小
4、容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。2、淋巴细胞增殖反应： 将5105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5 CO2，37培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/mlMTT液，10ul/孔。37培养4-6小时。 4. 1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150lDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS100ul/孔，过夜。，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸异丙醇100ul）用酶标测定仪测O
5、D值，测定波长570nm。 实验结果 将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。 转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。 注意事项 （1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。 （2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前
6、景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。 (一)主要试剂材料 1.试剂IL-2；RPMI-1640； 、型胶原酶，DNA酶；四甲基偶氮盐；酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；96孔细胞培养板。 2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%20% NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20%
7、NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2106/ml备用。 (二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导 (1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1106/ml。(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37，5 % CO2条件下培养，23d换液一次。吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20% NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。 (三)脾细胞的
8、制备及其LAK细胞的体外诱导 将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 % NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37，5%CO2条件下培养，23d换液一次。 (四)TIL细胞的分离制备及其诱导 (1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。 (2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10 20m1，同时加人0.05%的、型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌46h。 (3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。
9、 (4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5l0min。 (5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)，然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液35ml。 (6)经15001800 r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。 (7)用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心510min。肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。TIL则用含20% NCS的
10、RPMI-1640调整细胞浓度为0.5 106/ml。(8)将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1m1/孔)，同时分别加人IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37，5%CO2温箱培养34周，其间35d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。 (五)LAK细胞和TIL活性的测定 LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞，如Rajf ，Dandi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51 Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。本节介绍MTT比色法。 (1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-164
11、0调整LAK细胞或TIL浓度至1.5106/ml。 (2) LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：120的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。同时将不同的白血病细胞株分别用20% NCS-RPMI-1640培养液调整至3 104一1105/ml，取100ul细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。 (3)将上述接种好的细胞培养板置37，CO2温箱孵育20h，其余步骤同IL-2生物活性测定。(4)细胞毒性百分率(%)按下列公
12、式计算 ODE + T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值 ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值 ODT=相应浓度单独靶细胞的OD三、小鼠造血干细胞/祖细胞免疫磁性分离操作步骤：1) 取小鼠骨髓用BD染色液制成约2108单细胞悬液2) 阻断：加入Ms Fc BlockTM置冰上15min,0.25mg/106细胞3) 加入Lineage Panel中biotin-mAb, 每种2ml/ 106细胞,冰上15min4) IMag buffer洗涤, 加Streptavidin磁珠, 5ml/ 106细胞, 6-12 30min5) 放入磁场中8min, 将上清小心吸出、收集6) 试管移出磁场, 加
13、buffer重悬阳性片断, 反复吹吸后放入磁场8min7) 小心吸出上清，一并收集8) 重复上两步操作 收集的上清中即为通过阴性分离法得到的造血干/祖细胞四、IL-2生物学活性检测（MTT）（一）原理白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。（二）材料 （1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mm
14、ol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。 （2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4避光保存。 （3）IL-2标准品。 （4）PHA（200ug/ml）。（三） 方法 （1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生： 人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1105/ml加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5m
15、l，37度，5% CO2孵育48小时。 回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。 （2）IL-2生物活性测定 CTLL-2细胞制备：取传代培养2448小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1105/ml。 加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。37，5% CO2孵育40小时。 MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。 测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。 计算：用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A57
