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1、实验一：氨基酸的分离鉴定-纸层析法一、目的:诵过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、原理：层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异， 使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动 相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般 化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换 层析等。纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸
2、混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性 鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一 中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个 互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的 羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相 水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使 这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经 过层析点时，层析点上的溶
3、质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而 进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶 质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因 而可以彼此分开。纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的 另一端。在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当 把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在 两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用a表示）不同，使不同的氨基
4、酸分布在 滤纸的不同位置上而得到分离。一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（a）。分配系数不同：物质在溶剂I中的浓度物质在溶剂II中的浓度某一种物质在特定的溶剂系统、纸、展层方式、温度、pH等条件下的Rf值基本上是常数。Rf 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、纸层析纸的质量（新华一号）和层析温度等因素有关。物质被分离后在纸层析图谱上的位置Rf值（比移）来表示:原点到层析点中心的距离Rf =原点到溶剂前沿的距离印三酮颜色反应：印三酮在弱酸溶液中与-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧、脱羧反应，最 后印三酮与反应产物一氨和还原印三酮（hydrindantin）发生作用，生成紫色
5、物质（NH3与印三酮 反应形成紫色化合物）。用纸层析法或柱层析把各种氨基酸分开后，利用印三酮显色可以定性鉴定应 用分光光度法在570nm定量测定各种氨基酸。两个亚氨基酸，脯氨基酸和羟脯氨基酸与印三酮反应不释放NH3,而直接产生亮黄色化合物 最大光吸收在440nm。亮氨酸bb0 0 0 0 0 0、缬氨酸脯氨酸（黄色）苯丙氨酸赖氨酸纸庶析中Rf=X/Y三、器材；1、层析缸（两人一组，四组共用一个层析缸）2、培养皿（两人一组）；3、毛细管（药品是两 组共用一套）；4、喷雾器；5、层析滤纸（新华一号）四、试剂1、扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物（p.123）；（水饱和的正丁醇和乙酸的混
6、合物。其中被滤纸吸附的水为固定相，正丁醇为流动相，乙酸为层析提供酸性环境。）2、氨基酸溶液:0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各 组分均为0.5%）；3、显色剂：0.1%水合印三酮正丁醇溶液五、操作:1、平衡：将盛有平衡溶剂的培养皿放入密闭的层析缸中，倒1厘米厚的扩展剂；2、滤纸（新华一号或者Whatman-1号）：在纸的一端距边缘23cm处用铅笔划一条直线，在 直线上每隔2cm作一记号（如书p.123），共6个记号，这个记号是样品Rf值计算的原点;3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，点样量以3040uL为宜，每点一 次样，用吹风机吹干，然
7、后再点一次；重复点样34次。注意：点样时毛细管垂直轻轻接触滤纸，一触即止，每个点在纸上扩散的直径最大不超过 3mm o4、扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动 过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂 的液面需低于点样线1cm。待溶剂上升15cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然 干燥或吹风机吹干。5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1%印三酮正丁醇溶液（与水不混溶且挥发性较大的溶剂），用 热风吹干（或烘箱100C烘烤5分钟）显出个层析斑点（为什么这儿要热风？氨基酸与印三酮共热反应显色）。六、结果与分析：计算各种
8、氨基酸的Rf值。【注意事项】1、取滤纸之前要将手洗干净，防止手上的汗渍污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；在条件允许的 情况下也可戴一次性于套拿滤纸。要将滤纸平放在干净的报纸上，千万不要放在实验台上，以防止 污染。2、点样点（垂直点样）的直径不能超过3mm,否则分离效果不好，并且样品用量过大，会造成“拖尾”现象；点样一次后立即吹干，然后再点。平衡剂的作用：平衡剂起到使纸层析上吸附的溶剂达到饱和，使物质在展开剂和纸层析上吸附 的溶剂中溶解度不同而分离。展层方式有上行、下行和环行。虽然其方式可以不同，但其共同点都是将点好样品的滤纸固定， 让溶剂扩展，层析缸内保持恒定的蒸气压并保持恒温，减少温度波动使溶剂
9、走的不均匀，从而改变 Rf 值。上行层析是比较常用的方法，它的优点是可以在两个方向上进行（双向层析）。下行层析适 用于一些Rf值接近的混合物。此时不能测定Rf值，而只能与标准参考物相比较。附：影响 Rf 值的因素1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有 机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨 基酸的极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此 Rf 值低于后者。氨基酸 的极性愈大，Rf值愈小。ch2基（亚甲基）是疏水性基团，如果分子中极性基数不变，则一ch2基增加，整个分 子的极性降低，因此
10、易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值也随之增加。例如氨基酸的Rf值：甘氨 酸 丙氨酸 亮氨酸 ；二羧基氨基酸中，天门冬氨酸 谷氨酸。极性基团的位置不同也会引起Rf值变化。纸层析时，由于各个氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值，因此被分开（可以用双向纸 层析法）。当混合物中所含的氨基酸种类较少，Rf值彼此差距比较大，则在同一溶剂系统进行单向 层析即可。2、溶剂的影响：同一种物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应该使被分离物质在适当Rf值范围内（0.05-0.85之间），并且不同物质的Rf值至少差别为0.05才能彼此分开。溶剂的极性大小也影响物质的Rf值，在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基
11、酸的Rf值随着 溶剂碳原子数目的增加而降低。3、pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式。对于酸性氨基酸则在酸性时所 带净电荷比碱性时少。带电荷愈少亲水性愈小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性大。而碱性氨基酸则 与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。溶剂的pH还可以影响有机溶剂的含水量，溶剂酸碱度大，则含水量高。对于极性物质来说Rf 值增加，非极性物质则减少。若pH值不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf值也略有不同， 则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸中用酸或碱气体饱和 才可以防止上述现象，使物质得
12、到圆点状图谱。4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密、有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中有 Ca2+、Mg2+、Cw+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸洗涤滤纸 除去之。一般分析工作可采用新华1号滤纸（或者Whatman 1号），若有较多样品需要在纸上分离提 纯时则适合采用新华3号（或Whatman 3号）厚纸，但厚纸的分辨率比1号滤纸差。溶剂顺着纸的 纹道扩展速度快，否则速度慢。5、温度和时间的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤 维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析时最好在恒温室中进行，控制温度相差不超 过0.5C。当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，Rf值则小。除上述影响因素外，样品中含有盐份和其它杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。必要 时，使用前可将滤纸用缓冲液浸泡或经乙酰化作用进行化学修饰。
