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1、富含多糖和次生代谢产物的白桦成熟叶中总RNA的提取 植物生理学通讯 曾凡锁酚类物质是植物所特有的次生代谢物，它很容易被氧化成褐色的醌类物质，醌类物质与 RNA的不可逆结合，不仅会使RNA的活性丧失，而且在苯酚和氯仿抽提时还会使RNA丢失，因此富含次生代谢产物的植物RNA提取一直是RNA分析研究中的障碍。要获得完整性好的RNA，植物细胞破胞必须完全、迅速。细胞破碎不完全，不仅使RNA产量降低，而且还会因为植物细胞内部结构的破坏而产生内源性降解；时间过长则已释放的RNA酶还有可能会产生活性而降解RNA。因此这是能否获得高质量RNA的最为关键性的一步（王玉成 2002）。其次则应考虑如何去除多糖。但
2、CTAB法通常要结合其他操作才能有效去除多糖，常见的方法有低浓度乙醇沉淀法、醋酸钾沉淀法、氯化锂沉淀法、提高缓冲液的氯化钠浓度等。其中用氯化锂沉淀RNA是RNA提取中的常用方法，此法制备的RNA具有纯度高和无多糖等生物大分子共沉淀等优点。改良CTAB-LiCl法提取枣总RNA体系的建立 中国农学通报 宋蓓 比较不同沉淀方法CTAB较其它几种试剂更能有效去除多糖和酚类等物质。-巯基乙醇和PVP去除酚类， KAc及无水乙醇去除多糖。RNA的沉淀方法很多，如LiC1、异丙醇、NaAc和无水乙醇等。本试验对不同的方法进行了比较，其中LiC1沉淀需要在4放置过夜，时间长，但是RNA的产率比后两种方法高很
3、多，且RNA纯度好，没有DNA污染，不需要进行去除DNA的纯化操作，减少了RNA降解的几率；LiC1本身沉淀大片段RNA效果好的特点使得到的RNA大片段损失很少，更适于进行后续的分子生物学试验；而异丙醇沉淀获得的沉淀体积大，导致了多糖和酚类物质的共沉淀作用；1/10体积3 mol/L的NaAc和2.5倍体积的无水乙醇所得的RNA产率较低，且和异丙醇沉淀方法一样存在基因组DNA的污染，后续的纯化操作提高了RNA提取的成本且增加了降解的机会。几种果实总RNA提取方法的评价 广东农业科学 陈弟 多种RNA提取方法的原理Trizol法即异硫氰酸胍苯酚法，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解，而
4、酚的作用是使蛋白变性。其原理是内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。热硼酸法 (Hot-borate，简称HB法)的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物，二硫苏糖 醇(DTT)作为还原剂，NP-40可阻止酚类物质氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体，这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的
5、氧化及其与RNA的结合，通过LiC1沉淀剩余的酚类物质，从而与RNA分开。异硫氰酸胍法(Guanidine Thiocyanate，简称GT法)的提取液包括4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸钠( p H 7.0 )、0.5十二烷基肌酸钠、0.1 mol/L-巯基乙醇。其中，异硫氰酸胍作为强变性剂使核酸一蛋白结构发生变化，并有效解离核蛋白与核酸的复合体， 与-巯基乙醇共同对RNase产生强烈的抑制作用，这样能破裂细胞并迅速释放核酸，然后通过CsCl梯度密度离心去除DNA，有效地得到总RNA。十二烷基硫磺酸钠法(Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS法) 的提取液
6、有 0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)、0.05 mol/L EDTA (pH8.0)、0.5 mol/L NaC1、1.5SDS、0.01-巯基乙醇。SDS是一种离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖；EDTA以螯合二价金属离子，抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液可提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如-巯基乙醇)，可以降低酶类(尤其是氧化酶类)的活性。通过苯酚和氯仿等有机溶剂的抽提去除蛋白质、多糖和酚类等杂质后，加入无水乙醇进行沉淀，即可使RNA分离出来。十六烷基三甲基溴化铵法
7、(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide 简称CTAB法)的抽提缓冲液包括2 CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4 mol/L NaC1、20 mmol/L EDTA (pH 8.0)。其中，CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游离出来；EDTA以螯合二价金属离子抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如-巯基乙醇) ，以降低酶类(尤其是氧化酶类) 的活性。而添加的苯酚和
8、氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性并使抽提液分相，由于RNA溶于水相，因此经离心后即可从抽提液中去除细胞碎片和大部分蛋白质；上清液中加入的无水乙醇可使 RNA沉淀，将沉淀出的RNA溶于TE溶液中即得RNA溶液；添加的还原剂(如-巯基乙醇)和鳌合剂(如PVP) 可防止多酚氧化；低浓度乙醇或醋酸钾可去除多糖，从而达到高度纯化RN A的目的。上述5种果实总RNA提取方法的步骤基本相似，主要包括以下几个基本步骤：一是彻底破碎果实细胞的细胞壁；二是使核蛋白复合体中的蛋白质充分变性，实现核蛋白与核酸的分离；三是抑制内源和外源RNA酶的活性，防止RNA受污染而降解，这是能否成功获得高质量RNA的关键步骤；四是将R
9、NA与DNA、蛋白质、多酚、多糖等物质分离；五是检测RNA的质量。然而，对于富含多酚、多糖和次生代谢物等的果实，上述5种提取方法都各有优缺点。其中试剂盒法，因操作简单、材料用量少，在果实总RNA的提取上应用较多，但其价格高、并不适用于所有果实。且较难提取得到高质量的果实总RNA；热硼酸法，通过高浓度的硼酸盐抑制氧化酶，使RNA免受多酚的干扰，且蛋白酶K可降解酚类和次生物质氧化酶，因此获得的RNA纯度最高、完整性一般，但是该法所需药品多、价格高，且提取时问也较长、操作较复杂，容易被外源RNA酶降解；异硫氰酸胍法，因异硫氰酸胍能强烈抑制果实及提取液中RNase的活性，方法操作简单、完整性好、产量高
10、、所需时间短、成本低，但提取的RNA纯度不是很高，需要用试剂盒法或其他方法作进一步纯化；SDS法可以有效去除果实中的多糖和酚类物质，但提取的RNA纯度仍不是很高；而CTAB法，能较好地解决以上4种方法存在的种种问题，所提取的总RNA完整性最好， 获得的数量也比较大，且所需药品简单，是提取果实总RNA较有效的一种方法。庄军平等在配制提取缓冲液时加入20 mmol/L EDTA ( pH8.0 )，并于加样前在提取缓冲液预热时加入0.3 mL-巯基乙醇，有效抑制了酚类物质的氧化，这种处理比单独加入-巯基乙醇或PVP的效果要好；此外，在用苯酚、苯酚：氯仿( 1：1 ) 和氯仿进行抽提后，加入1/15
11、体积3 mol/L NaAc ( pH 5.2 ) 和1/5体积的无水乙醇混匀,并在冰浴上静置2 h，可促进多糖沉淀而不聚沉RNA分子；最后在弃除多糖沉淀的上清液中加入终浓度为0.3 mo1/L的NaAc和3倍体积的无水乙醇，并于-70下放置3 h后过夜，即可获得高质量的RNA。提取高质量茶树总RNA的方法研究 安徽农业大学学报 史成颖在研磨材料时加入5左右不溶性的PVPP，有利于去除材料中的多酚，提高RNA的完整性；CTAB裂解液中加入2的-巯基乙醇可以抑制多酚的氧化和酶的水解，释放出细胞中的RNA；8 mol/L LiC1沉淀过夜可以有效地去除多糖，进一步除去RNA中的DNA污染；往沉淀中
12、再次加入裂解液，可使第一次裂解不补充的部分进一步裂解，提高RNA的纯度。银杏总RNA的提取 安徽农业科学 李先良使用CTAB可以有效去除多糖、酚类物质的影响，可以获得较高质量的RNA。PVP作为酚类化合物的螯合剂，具有很强的结合酚类物质的能力，使之不被氧化成醌类物质，有效地防止其与RNA的结合。-巯基乙醇作为强还原剂能防止多酚氧化，还可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活， 同时-巯基乙醇还可以抑制RNA酶的活性。同时加入PVP和-巯基乙醇可以更好地去除多酚类物质的影响。用CTAB-PVP法提取棉花各组织总RNA的研究 中国农业大学学报 刘洋 CTAB是一种强变性剂，变性效果优于SDS，能够有效除
13、去蛋白(含复合蛋白)等杂质。此外，与常规的CTAB法比较，本方法还有如下改进：1) 在提取液中加入较高质量浓度的PVP。这不仅能有效地去除棉花组织中的酚类物质和多糖，还能去除一些其他色素物质和脂类，提高RNA的完整性和纯度。2) 在提取液中加入-巯基乙醇。棉花中含有大量的酚类物质，在细胞破碎时其自动氧化而与RNA不可逆地结合，从而影响RNA的产率和纯度，这也是棉花RNA难以提取的重要原因。在提取液中加入-巯基乙醇，这不仅避免了酚类物质的氧化，还提高了RNA的产率和纯度。3) 在用苯酚：氯仿抽提时，使用低pH的苯酚( pH 4.0 )。苯酚在低pH的情况下能促进水相中的蛋白和DNA向有机相分配，
14、从而最大限度的除去总RNA中的蛋白和DNA。4) 用LiCl选择性的沉淀RNA。这可以充分除去RNA中的DNA污染。如果必要，可以进行2次LiC1沉淀，但是，最后一步必须用70(体积分数) 乙醇洗涤2次，避免RNA中因含有LiCl而影响反转录的效果。CTAB法个人总结总RNA提取方法的步骤基本相似，主要包括以下几个基本步骤：一是彻底破碎果实细胞的细胞壁；二是使核蛋白复合体中的蛋白质充分变性，实现核蛋白与核酸的分离；三是抑制内源和外源RNA酶的活性，防止RNA受污染而降解，这是能否成功获得高质量RNA的关键步骤；四是将RNA与DNA、蛋白质、多酚、多糖等物质分离；五是检测RNA的质量。酚类物质很
15、容易被氧化成褐色的醌类物质，醌类物质与 RNA不可逆的结合，不仅会使RNA的活性丧失，而且在苯酚和氯仿抽提时还会使RNA丢失。常见的去除多糖的方法有低浓度乙醇沉淀法、醋酸钾沉淀法、氯化锂沉淀法、提高缓冲液的氯化钠浓度等。在用苯酚、苯酚：氯仿进行抽提后，加入1/15体积3 mol/L NaAc ( pH 5.2 ) 和1/5体积的无水乙醇混匀,并在冰浴上静置2 h，可促进多糖沉淀而不聚沉RNA分子；最后在弃除多糖沉淀的上清液中加入终浓度为0.3 mo1/L的NaAc和3倍体积的无水乙醇，并于-70下放置3 h后过夜，即可获得高质量的RNA。RNA的沉淀方法很多，如LiC1、异丙醇、NaAc和无水
16、乙醇等。但是前者所得的RNA的产率比后两种方法高很多，且纯度好，没有DNA污染，不需要进行去除DNA的纯化操作，减少了RNA降解的几率；LiC1沉淀大片段RNA的效果好，更适于进行后续的分子生物学试验；而异丙醇沉淀获得的沉淀体积大，导致了多糖和酚类物质的共沉淀作用；1/10体积3 mol/L的NaAc和2.5倍体积的无水乙醇所得的RNA产率较低，且和异丙醇沉淀一样存在基因组DNA的污染，后续的纯化操作提高了RNA提取的成本且增加了降解的机会。CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游离出来，较其他几种试剂更能有效去除多糖和酚类等物质。-巯基乙醇是一种强还原剂，可以抑制多酚的氧化和酶的水解，释放出细胞中的RNA。可以降低酶类(尤其是氧化酶类)的活性（通过打断多酚氧化酶的二硫键使之失活），还可以抑制RNA酶的活
