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1、动物细胞培养技术(1)动物细胞培养技术复习思考题1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？答：离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。器皿使用高压灭菌锅，121.3，2030分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。2.叙述超净工作台的工作原理？答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。3.正
2、压过滤器为何会除菌？答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。你认为精确配制各种溶液？答：5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）3.0（黄），6.5（棕色）8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制答：Ca2、Mg2是细胞
3、膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca2、Mg2离子的D-Hanks液或PBS液。7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？答：L谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。8.HEPES溶液的作用机理？答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？答：平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗
4、、细胞的漂洗、配制其他试剂等。作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质； b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源； d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。10.营养液制备后为什么要小剂量分装？答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法
5、？答：12.细胞培养过程中对无菌的要求很高，你认为该如何操作才能保证培养过程中无微生物污染？请详细阐述。答：实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验进无菌室前要彻底洗手使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。）
6、吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用13.你认为组织块培养成功需哪些条件？你们小组为了实验成功采取了哪些具体的措施？你在本次实验中做了什么工作？答：实验所用的器材必须保证无菌无毒，用胰蛋白酶（浓度适中）消化的时间不宜过长和过高14.组织块培养的基本原理如何？答：细胞增殖15.何时须更换培养基进行传代？可否使用与原先培养条件不同之血清种类来进行后期的培养？答：一般两天换一次,如果细胞贴壁率变化不大,可以适当延长,到细胞贴壁率达到85左右,可以传代不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所
7、不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。16.培养细胞时不用CO2或使用5 % 或10% CO2是否都可以？说明原因？答：不是。一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度.当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时,细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g时,则应使用5 %CO2培养细胞.17.你认为心肌细胞培养的基本操作要点是什么？你在其中参与了什么操作？有什么体会？答：要点：1）、首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据组织是否分散成细胞
8、团或单个细胞，采取终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。2）、低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。3）、用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。4）、将培养瓶放入37恒温箱中培养。5）、每隔2到3天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。18.培养瓶移入CO2恒温箱培养时，瓶盖为何要稍松？又如何避免细胞污染？如果细胞污染有何挽救措施？答：拧紧瓶盖无法进行气体交换，瓶盖稍松才能为细胞生长提供必要的氧气和二氧化碳，尤其是二氧化碳特别重要，细胞在酸性培养液中生长的更好19.胰蛋白酶的消化原理如何？如何初步判断胰蛋白酶的消化时间？答：原理：细胞外含有多种胞外蛋白,如胶原蛋白；使细胞间或细胞与培养瓶内壁粘连起来.用胰蛋白酶分解这些蛋白质后就可以使它们分开了! 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再链接成片，表明此时细胞消化适度。 210分钟20.细胞培养到一定时间为何要进行传代？能一直传代下去吗？阐述其机理。答：因为进入衰亡期,细胞发生接触抑制,营养逐渐耗尽,有毒废物积累,细胞变大自溶.这时就要重新接种培养。不能。正常细胞每分裂一次端粒会逐渐缩短，分裂次数过多会衰老直至死亡。但肿瘤细胞除外。
