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1、尼古丁对Apo-E敲除小鼠调节性T细胞及对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一组称为动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种。各种动脉硬化的共同特点是动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。动脉粥样硬化的特点是受累动脉的病变从内膜开始,先后有多种病变合并存在,包括局部有脂质和复合糖类积聚、纤维组织增生和钙质沉着形成斑块,并有动脉中层的逐渐退变,继发性病变尚有斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成(称为粥样硬化-血栓形成(atherosclerosis-thrombosis)。现代细胞和分子生物学技术显示动脉粥样硬化病变具有巨噬细胞游移、平滑肌细胞
2、增生；大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质形成；以及细胞内、外脂质积聚的特点。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样,因此称为动脉粥样硬化。尼古丁是一种难闻、味苦、无色透明的油质液体,挥发性强,在空气。中极易氧化成暗灰色,能迅速溶于水及酒精中,通过口鼻支气管粘膜很容易被机体吸收。粘在皮肤表面的尼占丁亦可被吸收渗入体内。当尼古丁进入人体后,会产生许多作用：如四肢末梢血管收缩、心跳加快、血压上升、呼吸变快、精神状况改变(如变得情绪稳定或精神兴奋),并促进血小板凝集,为造成心脏血管阻塞、高血压、中风等心脏血管性疾病的主要帮凶。载脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)是一种
3、多态性蛋白,参与脂蛋白的转化与代谢过程,其基因可以调节许多生物学功能,与许多心血管疾病发病有关,对ApoE及其基因多态性的研究是目前医学研究的热点之一,探讨两者之间的内在联系,对心血管病的预防、诊断及治疗具有重要的临床应用价值。载脂蛋白E主要存在于CM、VLDL、IDL和部分HDL中,正常人血浆ApoE浓度为0.03-0.05g/L。Apo E的浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。ApoE生理功能有：是LDL受体的配体,也是肝细胞CM残粒受体的配体,它与脂蛋白代谢有密切相关性；ApoE具有多态性,多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关；参与激活水解脂肪的酶类,参与免疫调节及神经组织
4、的再生。转化生长因子-(transforming growth factor-,TGF-)是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-超家族。这一家族除TGF-外,还有活化素(activins)、抑制素(inhibins)、缪勒氏管抑制质(Mullerian inhibitor substance,MIS)和骨形成蛋白(bone morpho-genetic proteins,BMPs)。TGF-的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化,即在表皮生长因子(EGF)同时存在的条件下,改变成纤维细胞壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力,并失去生长中密度信赖的抑制作用。TGF-与
5、早先报道的从非洲绿猴肾上皮细胞BSC-1所分泌的生长抑制因子是同-物。起初对TGF-的生物学功能研究主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面,近年来发现TGF-对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。TGF-1、2和3功能相似。一般来说,TGF-对间充质起源的细胞起刺激作用,而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用。TGF-的生物学作用主要包括以下几方面：(1)抑制免疫活性细胞的增殖；(2)对细胞表型的调节；(3)抑制淋巴细胞的分化；(4)抑制细胞因子产生：如抑制PBMC中IFN-和TNF-的产生。(5)其它调节作用。TGF-不仅是结缔组织的强力激活剂,而且还是至今最强力的平滑肌增值抑制剂
6、。从某种意义认为,大多数细胞能形成TGF-,但以血小板和活跃的巨噬细胞形成为多。细胞分泌的TGF-p大多数呈潜伏状,在PH值降低或水解蛋白质的分裂时才有活性。平滑肌增殖抑制剂如TGF-p和刺激剂如PDGF之间的平衡,对平滑肌细胞是否有增值反应并导致动脉粥样硬化病变的形成很重要。因此,如果由巨噬细胞衍生的泡沫细胞在内皮下间质适当活跃时,可明显影响生长因子的分泌,从而趋化吸引平滑肌细胞从间质转移到内膜,并形成内膜、肌纤维、增殖性病变。TGF-在治疗伤口愈合,促进软骨和骨修复以及通过免疫抑制治疗自身免疫性疾病和移植排斥等方面有潜在的应用前景。调节性T细胞(regulatory T cell, Tre
7、g)是一类具有负调节作用的T细胞亚群,包括在胸腺内分化而成的自然调节T细胞(如CD4+CD25+T细胞)和在胸腺外诱导产生的适应性调节T细胞(如Treg1细胞和Th3细胞)。调节性T细胞是不同于Thl和Th2的具有调节功能的T细胞群体,因其具有免疫抑制作用,在多种免疫性疾病中起重要的调节作用,近来受到人们的广泛关注.TGF-是Treg细胞功能与动脉粥样硬化相关的2个主要介质之一。自从发现TGF-缺陷小鼠引发多种炎症疾病后,TGF-在免疫系统中的作用得到重视。这些与加强T细胞增殖,激活及T细胞向Th1和Th2分化相关联。在这种情况下出现的T细胞激活缘于TGF-有抑制增值,激活及T细胞向Th1和T
8、h2分化的作用。此外,TGF-1在外周组织中像一个协同刺激因子去维持Treg细胞表达Foxp3。这种在效应T细胞及Treg细胞上的双重效应可能有助于TGF-调节外周T细胞耐受。细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,也称为程序性细胞死亡。凋亡作为生理过程在确保正常发育、生长,维持内环境稳定中起重要作用,并发挥积极的防御功能。尼古丁可以调控细胞凋亡,这种调控既可以通过多种受体如尼古丁型乙酰胆碱受体、多巴胺受体、影响谷氨酸受体的表达等来调控细胞凋亡,也可以尼古丁通过多种信号通路调控细胞凋亡,人们已经发现与尼古丁相关的信号通路有Ca2+、3种MAPK途径(ERK、p38和
9、JNK/SAPK)、AKT途径和线粒体途径等。人们对尼古丁调控细胞调亡的现象开展了大量的研究,对尼古丁调控凋亡的分子机制也已经有比较系统的了解,并对尼古丁调控凋亡的生物学意义有了更深层次的理解。目的探讨不同浓度尼古丁刺激下,动脉粥样硬化斑块形成的变化及对外周血调节性T细胞的影响。方法通过2种不同浓度2.0、0.5mg/(kgd)的尼古丁和生理盐水对Apo-E-/小鼠腹膜下注射12周后(共18只,随机分为高尼古丁组、低尼古丁组、空白对照组,每组6只),用流式检测外周血调节性T细胞改变及对Apo-E-/-小鼠的主动脉根部行病理切片及HE染色。统计分析采用SPSS13.0统计软件,计量资料用均数标准
10、差(xs)表示,采用重复测量方差分析对小鼠体质量、调节性T细胞/CD4值、转化生长因子1值进行分析其差异,对组内处理前后数据采用配对t检验分析其差异,采用One-way ANOVA分析组间差异；采用One-way ANOVA分析3组小鼠血脂及斑块面积的差异；采用Pearson相关系数对处理后调节性T细胞/CD4值与斑块面积、处理后的转化生长因子1值与斑块面积进行相关性分析。各组间多重比较方差齐的用LSD检验,方差不齐的用Tamhane检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1时间因素对小鼠体质量的影响具有显著性差异(时间主效应F=40.193,P<0.01),分组因素对小鼠体
11、质量的影响无显著性差异(分组主效应F=0.079,P>0.05),两者交互效应不显著(F=0.728,P=0.499)。处理后12周小鼠体质量大于处理前,尼古丁对小鼠体质量无明显影响。2尼古丁有降低总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及升高低密度脂蛋白胆固醇趋势,但在血脂四项指标中,每项指标各组差异均无统计学意义(P>0.05)。3尼古丁对ApoE敲除小鼠主动脉根部斑块组织学特征的影响：实验12周后取小鼠主动脉做切片及HE染色,在横切面,3组的ApoE敲除小鼠均可见多处动脉粥样硬化病变,且可见到纤维病变和粥样病变等不同发展阶段的斑块,引起血管不同程度狭窄。12周后,与空白对照组比较,低、高
12、尼古丁组粥样斑块面积均增大,尼古丁浓度越高,斑块面积越大。组间有显著性差异,两两比较(Tamhane法)均有显著性差异(F=89.213,P=0.000)。4经重复测量方差分析,时间因素、分组因素两者交互效应显著(F=12.521,P=0.001)。不同组间处理前调节性T细胞/CD4值差异无统计学意义(F=0.406,P=0.674),不同组间处理后调节性T细胞/CD4差异有统计学意义(F=11.934,P=0.004)；此外对照组处理前后调节性T细胞/CD4值差异无统计学意义(t=-0.035,P=0.973),低尼古丁组处理前后调节性T细胞/CD4值差异有统计学意义(t=8.933,P=0
13、.000)、高尼古丁组处理前后调节性T细胞/CD4值差异有统计学意义(t=4.887,P=0.005)。处理后12周小鼠调节性T细胞/CD4值小于处理前,不同浓度的尼古丁均可以降低调节性T细胞/CD4值。5经重复测量方差分析,时间因素、分组因素两者交互效应显著(F=15.302,P=0.000)。不同组间处理前TGF-1值差异无统计学意义(F=0.053,P=0.949),不同组间处理后TGF-1值差异有统计学意义(F=35.640,P=0.000)；此外对照组处理前后TGF-1值差异无统计学意义(t=-0.247,P=0.815),低尼古丁组处理前后TGF-1值差异有统计学意义(t=3.74
14、8,P=0.013)、高尼古丁组处理前后TGF-1值差异有统计学意义(t=7.374,P=0.001)。处理后12周小鼠TGF-1值小于处理前,2种浓度的尼古丁均可以降低TGF-1值。6.采用Pearson相关系数对粥样斑块面积与TGF-1值进行相关性分析,结果提示：粥样斑块面积与TGF-1值呈负相关(r=-0.892,P=0.000)。7.采用Pearson相关系数对粥样斑块面积与调节性T细胞/CD4值进行相关性分析,结果提示：粥样斑块面积与调节性T细胞/CD4值呈负相关(r=-0.739,P=0.000)。结论1尼古丁可以促进动脉粥样硬化斑块的形成,可能与尼古丁减少调节性T细胞的数量及TG
15、F-1相关。2粥样斑块面积与TGF-1值呈负相关.3粥样斑块面积与调节性T细胞/CD4值呈负相关。目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs;通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300ng/m1)刺激HUVECs24h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。采用SPSS13.0软件对实验结果进行统计学分析,实验数据用(xs)表示,多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐则采用LSD法,如方差不齐则采用Tamhane法,相关性分析采用Pearson相关系数,以P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1在细胞凋亡方面,各组间
16、比较具有统计学意义(F=12.955,P<0.05)；低浓度尼古丁(3ng/m1)促进细胞凋亡最强,与其余3组比较均具有统计学意义(P<0.05)；但对照组与高浓度尼古丁组(300ng/m1)、中浓度尼古丁组(30ng/m1)与高浓度尼古丁组(300ng/m1)之间差异无统计学意义(P>0.05)。2在细胞坏死方面,各组间比较具有统计学意义(F=83.728,P=0.000)随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,高浓度尼古丁(300ng/m1)促进细胞死亡最强,各组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。3细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.866,P=0.000)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。
