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1、 体外构建气管黏膜上皮组织的研究 作者：吴明明，崔鹏程，赵大庆,郑德育,段小红 【摘要】 目的: 应用组织工程原理和方法在体外构建气管黏膜上皮组织. 方法: 将原代兔气管上皮细胞种植在铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层（SIS）上培养，在体外构建气管黏膜上皮组织，培养1 wk后行HE染色，对气管上皮细胞行免疫细胞学鉴定. 结果: 原代气管上皮细胞培养1 wk后增殖旺盛，10 d时上皮细胞分布范围更广. 将构建的气管黏膜上皮组织行HE染色，显示有气管黏膜上皮和SIS双层结构. 抗角蛋白单克隆抗体免疫细胞化学反应阳性显色率可达90%左右. 结论: 将铺有鼠尾胶原的SIS复合气管上皮细胞生长，成功的在体外构
2、建出组织工程化的气管黏膜上皮组织. 【关键词】 支气管/细胞学；上皮细胞；小肠黏膜下层；组织培养；组织工程 0引言 目前，在因外伤、肿瘤或其他病变导致气管大范围受损、需要切除较长段气管的情况下，尚缺乏有效的方法来修复缺损气管. 利用同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，效果均不理想1. 近年来，气管组织工程技术为这一问题的解决打开了新的视角. 其中，有活性的气管黏膜上皮的重构仍是气管移植的关键. 本研究在原代培养兔气管上皮细胞的基础上，将铺有鼠尾胶原的小肠黏膜下层（small intestinal submucosa, SIS）作为支架，复合原代气管上皮细胞生长，试图在体外构建出
3、组织工程化的气管黏膜上皮组织. 1材料和方法 材料健康成年大耳白兔20只，体质量（）kg，雌雄不限，购于第四军医大学实验动物中心. 无血清生长因子培养基(以下简称无血清培养基)成分为：11 DMEM/F12培养液，并加入以下激素及生长因子：10 g/mL胰岛素(INS)，5 g/mL转铁蛋白(TF)，25 ng/mL表皮生长因子(EGF)， 20 ng/mL甲状腺素(T3)， g/mL氢化可的松(HC)， 1 mmol/L L谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素. 其中DMEM/F12培养基为Gibco产品；胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、甲状腺素以及第一抗体鼠抗兔角蛋白单
4、克隆抗体（C1801）均为Sigma公司产品；余为国产分析纯. 二氨基联苯胺DAB免疫组化试剂盒由华美公司提供. 鼠尾胶原浓度为 g/L（钼酸比色法），由本校生物医学工程系提供. 方法 消毒法制备SIS将兔以20 g/L戊巴比妥钠全麻致死（ mL/kg），无菌切取近端空肠，沿管腔的垂直面截取约10 cm长度数段（管壁无破损），清水冲洗干净之后浸于生理盐水中. 翻转小肠，用裹着纱布的手术刀柄沿管腔纵向刮除黏膜层，直至黏膜下层. 再次翻转小肠，用同样的方法刮除浆膜层和肌层，即得SIS. 用生理盐水洗净小肠黏膜下层，仔细去除黏膜下层的残余组织. 沿纵轴切开，切成1 cm长的小段，在含青霉素、链霉素（
5、均为200 U/mL）的生理盐水中浸泡30 min 3次，再浸入2 mL/L过氧乙酸（含50 mL/L无水乙醇）消毒30 min，无菌生理盐水漂洗3次，储存于无菌PBS（pH=）液中4冰箱保存. 取部分SIS行HE染色观察其结构. 原代气管黏膜上皮细胞的培养将兔以20 g/L戊巴比妥钠全麻致死，无菌操作取出颈段气管，用含有青霉素、链霉素（均为100 U/mL）的PBS溶液冲洗气管，机械法小心剥离气管黏膜，将黏膜剪切成1 mm2大小组织块；以眼科镊送入小号培养瓶内，用弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，再将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量上述无血清培养基，将培养瓶倾斜放置在37细胞培养箱中，
6、24 h待组织小块贴附后，将培养瓶翻转平放，静置培养. 以后每2 d更换1次培养液，2 d后小心将组织块倾倒出，继续培养细胞，10 d后，细胞基本长满瓶壁后，以 g/L胰酶进行消化，形成细胞悬液备用. 气管上皮细胞的鉴定以SP法对标本进行染色，主要实验步骤如下：将培养10 d的气管上皮细胞常规进行细胞爬片，40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min；加30 mL/L过氧化氢室温孵育10 min， PBS浸泡3次，每次5 min；滴加100 mL/L正常山羊血清37孵育10 min后去除多余液体；加第一抗体，4过夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加生物素标记第二抗体，37孵育30 min，PB
7、S冲洗3次，每次5 min；滴加SA/HRP（辣根酶标记链霉卵白素工作液），37孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，封片. 空白对照采用PBS代替一抗. 二氨基联苯胺DAB显色阳性为气管上皮细胞. 复合气管黏膜上皮组织的构建在六孔培养板中放入铺有鼠尾胶原的SIS小段，将上述细胞悬液滴在其上. 先不加培养液，在细胞培养箱中过夜后，再加入无血清培养基培养，以后每2 d更换一次培养液. 继续培养1 wk. 同时设对照组，将细胞悬液滴加到仅铺有鼠尾胶原的盖玻片上，以观察细胞生长情况. 石蜡切片HE染色将继续培养1 wk的复合气管黏膜上皮组织以100 g
8、/L甲醛固定24 h，石蜡切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察其结构. 2结果 气管上皮细胞培养过程倒置相差显微镜（Olympus CKX31,日本）观察原代气管上皮细胞生长情况，培养24 h内可见组织块边缘有少量成纤维样细胞爬出，呈放射状分布，随后可见一些纤毛细胞爬出，纤毛自细胞顶面伸出，摆动活跃. 此后组织块周围上皮样细胞数目逐渐增多，数天后上皮样细胞覆盖的面积逐渐增大，近组织块区域上皮细胞密集，远离组织块区域上皮细胞少见. 2 d后小心倾倒出组织块，继续观察，可见1 wk时细胞增殖旺盛，小片状细胞群逐渐融合成片，部分上皮细胞汇合成多角形铺路石样生长（图1A）. 10 d时，上皮细胞分布
9、范围更广，但纤毛细胞数量无明显增加. 此时细胞基本长满瓶壁. 消化后形成细胞悬液，因复合气管黏膜上皮组织铺有SIS组织，透光度减弱，不便观察细胞生长情况. 而对照组仅铺有一层鼠尾胶原，透光性良好. 故以对照组的细胞生长情况来评估实验组的细胞生长情况. 对照组继续培养1 wk时，可见细胞生长良好，并逐渐汇合成铺路石样生长，但纤毛细胞结构逐渐退化或消失（图1B）. 复合气管黏膜上皮组织HE染色可见气管黏膜上皮和SIS双层结构，气管黏膜上皮为一薄层组织，SIS层较厚，呈较均匀的结缔组织基质. 胶原层显示不明显（图2A）. 我们自制的SIS呈较均匀的结缔组织基质结构，有少许细胞碎片残留（图2B）. 气
10、管上皮细胞免疫细胞化学鉴定抗角蛋白免疫细胞化学反应显示，二氨基联苯胺DAB阳性显色的细胞可达90左右（图3）. 3讨论 组织工程技术运用工程学和生命科学的原理和A：复合气管黏膜上皮组织(:气管黏膜组织块,:气管纤毛上皮细胞)；B：SIS.方法，发展生物替代品以修复、维持或改善组织功能2. 目前，组织工程学在组织或器官修复替代的研究很广泛，如组织工程化软骨3、膀胱4、皮肤5等人体组织器官方面，都取得了一定的成绩. 然而，气管的呼吸功能重建方面仍进展缓慢. 重建呼吸道功能的基础是建立有呼吸道黏膜的气管软骨支架. 目前，软骨支架的构建已在裸鼠体内获得成功6. 但复合气管黏膜上皮的构建仍在不断探索之中
11、. 气管上皮细胞是构建气管黏膜上皮的关键. 目前，气管上皮细胞的培养方法致力于研究提高细胞的增殖能力，延长存活时间，促进其分化成熟，使其结构和功能更接近于生理状况. 有学者利用呼吸道上皮分离细胞进行培养7以及利用干细胞定向诱导分化产生气道上皮8，这些方法缺点是难以获得大量上皮细胞，且消化后细胞的功能和活性受到一定程度的影响. 干细胞定向调控成本高，分化不确定，难以获得实用性的上皮细胞. 本实验利用组织块法原代培养气管上皮细胞，对细胞损伤小，且操作简单、快捷；纤毛上皮细胞自组织块直接爬出，更好的保留了原有的生物学特性，其生长分布范围随培养时间延长而扩大. 为推迟纤毛结构退化过程的发生，我们使用无
12、血清培养基而不用含血清的培养基进行培养，因为无血清培养基中加入了表皮生长因子、激素等成分，替代了加速细胞老化的小牛血清，能使细胞的形态特征和生理功能更接近于正常机体细胞. 本实验应用鼠尾胶原作为细胞支架，其主要成分是型胶原蛋白，有利于气管上皮细胞的贴壁、展开和分化，同时可以维持上皮细胞的形态、促进纤毛的生成9. 且将鼠尾胶原均匀涂在SIS上面，可以形成一平坦的表面，有利于细胞黏附，并且SIS可以构成更类似于正常气管黏膜层的黏膜下结缔组织层. Sanderson等10认为鼠尾胶原能促进细胞的贴附、生长，并有良好的光学属性，有利于光学显微镜的观察. 故我们将对照组仅铺一层鼠尾胶原，以便观察细胞的生
13、长情况. 【参考文献】 1 Kushibe K, Nezu K, Nishizaki K, et al. Tracheal allotransplantation maintaining cartilage viability with longterm cryopreserved allograftsJ.Ann Thorac Surg, 2001,71(5):1666-1669. 2 Langer R, Vacanti JP. Tissue engineeringJ.Science,1993,260(5110):920-926. 3 孙安科，陈文弦，崔鹏程，等.同种异体工程化软骨的构建和修复甲状软骨缺损的实验研究J.中华耳鼻咽喉科杂志，2001，36（4）：278-280. 4 严泉剑，李六金，张宇梅，等.新西兰兔骨髓基质细胞构建组织工程膀胱的实验研究J.第四军医大学学报，2017，24（8）：719-722. 5 刘亚玲，金岩1 / 1
