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1、说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。嘌吟霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖 苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有 效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌吟霉素是氨酰-tRNA分子3末端的类似物，能够与核糖体的A 位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌吟霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致 蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌吟霉素的不成熟多肽。嘌吟霉素产生菌St rep tomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌吟霉
2、素N-乙酰转移酶(PAC), 赋予机体对嘌吟霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳 定转染细胞株。嘌吟霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数 都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌吟霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌 菌株。溶解性：溶于水，参考浓度 50mg/ml。使用方法1. 建议使用浓度哺乳动物细胞：1-10 p g/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125p g/mL。注：使用嘌 吟霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的 pH 值调
3、节，而且受宿主细胞本身的影响。2. 溶解方法 用蒸馏水溶解嘌吟霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 p m滤膜过滤除菌后分装于-20C冻存； 也可溶于甲醇，配制成 10 mg/ml 的储存液。3. 嘌吟霉素杀灭曲线的确定（以 shRNA 转染或者慢病毒转导为例）嘌吟霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置 等有关。为了筛选到稳定表达的 shRNA 细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌吟霉素至 关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve ）。1）Day 1： 24孔板内以58 x 104 cel
4、ls/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度 实验37C细胞孵育过夜；2）Day 2： a）准备筛选培养基：含不同浓度嘌吟霉素的新鲜培养基（如0-15p g/mL，至少5 个梯度）；b）往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基；之后37C孵育细胞；3）Day 4：更换新鲜的筛选培养基，并观察细胞存活率。4）根据细胞的生长状态，约 2-3天更换新鲜的筛选培养基；5）每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所 有非转导细胞的药物最低浓度。4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选等转染含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌吟霉素的培养基中增殖，以筛选出稳定转染
5、子。1）细胞转染48h后，将细胞（原样或稀释）置于含有适当浓度嘌吟霉素的新鲜培养基中培养。注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下 降。最好进行细胞分盘使其密度不超过 25%。2）每隔 2-3 天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。3）筛选 7 天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿主细胞 系和转染筛选效率。注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌吟霉素的筛选至少需要48h，有效浓 度嘌呤霉素的筛选周期一般在 3-10天。4）转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中，用选择培养基继续培养7天。此次富集 培养是为日后的细胞毒性实验做准备。 Y * 、八，I / r-. r *注意事项1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。2）嘌吟霉素为有毒化合物，操作时请小心拿放。
